|
Стр. 1
УТВЕРЖДАЮ
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации -
Первый заместитель
Министра здравоохранения
Российской Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
15 января 2002 г.
Дата введения -
1 апреля 2002 г.
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ
И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ХОЛЕРЫ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
МУ 4.2.1097-02
1. Разработаны сотрудниками Министерства здравоохранения
Российской Федерации Ю.М.Федоровым, Н.Я.Жилиной;
Ростовского-на-Дону научно - исследовательского противочумного
института Ю.М.Ломовым, Б.Н.Мишанькиным, Л.С.Подосинниковой,
Л.Г.Воронежской, И.Я.Черепахиной, Т.А.Кудряковой, Б.Л.Мазрухо,
Л.М.Смоликовой, И.В.Рыжко, Р.И.Цураевой, Э.А.Москвитиной,
Б.П.Голубевым; Противочумного Центра Минздрава России
А.А.Кюрегяном, С.М.Ивановой, Ю.С.Королевым; Российского научно -
исследовательского противочумного института "Микроб" А.К.Адамовым,
3.В.Малыхиной, Т.В.Бугорковой, Н.И.Смирновой, Л.Ф.Ливановой;
Иркутского научно - исследовательского противочумного института
А.С.Марамовичем, В.С.Ганиным, Л.Я.Урбанович, В.И.Погореловым;
Ставропольского научно - исследовательского противочумного
института В.Н.Савельевым; Причерноморской противочумной станции
Г.В.Гальцевой; Государственного Центра по антибиотикам
С.В.Сидоренко; Российской медицинской академии последипломного
образования Е.А.Ведьминой; ГИСК им. Л.А.Тарасевича Минздрава
России Т.И.Анисимовой, Л.В.Саяпиной.
2. Утверждены Главным государственным санитарным врачом
Российской Федерации - Первым заместителем Министра
здравоохранения Российской Федерации Г.Г.Онищенко 15 января
2002 г.
3. Введены взамен "Инструкции по организации и проведению
противохолерных мероприятий" утв. МЗ и МП РФ от 09.06.95
N 01-19/50-11.
1. ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ
1.1. Настоящие методические указания разработаны для внедрения
и применения санитарно - эпидемиологических правил СП 3.1.1086-02
"Профилактика холеры. Общие требования к эпидемиологическому
надзору" в части, касающейся организации и проведения лабораторной
диагностики холеры.
1.2. Настоящие методические указания предназначены для
специалистов бактериологических лабораторий центров
госсанэпиднадзора, лечебно - профилактических и противочумных
учреждений.
2. НОРМАТИВНЫЕ ССЫЛКИ
2.1. Санитарные правила по безопасности работ с
микроорганизмами СП 1.2.006-93. Ч. I: Порядок выдачи разрешения на
работу с микроорганизмами I-IV групп патогенности и
рекомбинантными молекулами ДНК.
2.2. Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп
патогенности: СП 1.2.011-94.
2.3. Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования
микроорганизмов I-IV групп патогенности: СП 1.2.036-95.
2.4. Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп
патогенности и гельминтами: СП 1.2.731-99.
2.5 Условия транспортирования и хранения медицинских
иммунобиологических препаратов: СП 3.3.2.0-28-95.
2.6. Профилактика холеры. Общие требования к
эпидемиологическому надзору: СП 3.1.1086-02.
2.7. Профилактика холеры. Организационные мероприятия. Оценка
противоэпидемической готовности медицинских учреждений к
проведению мероприятий на случай возникновения очага холеры: МУ
3.1.1096-02.
3. ХАРАКТЕРИСТИКА ВОЗБУДИТЕЛЯ ХОЛЕРЫ
Холера - острая инфекционная болезнь из группы карантинных
инфекций, с диарейным синдромом, фекально - оральным механизмом
передачи возбудителя, водным, пищевым и контактно - бытовым путями
распространения инфекции.
Холерные вибрионы относятся к виду V. cholerae, который
включает как патогенные, способные вызывать заболевания, склонные
к эпидемическому и пандемическому распространению, так и
свободноживущие в воде вибрионы, безопасные для человека или
обусловливающие спорадические случаи диарей и инфекций с
внекишечной локализацией возбудителя. Известно около 200
О-серологических групп холерных вибрионов, из которых лишь
холерные вибрионы O1 серогруппы до последнего десятилетия являлись
возбудителями грозной инфекции. С 1993 г. по решению ВОЗ как
холеру регистрируют заболевания, вызываемые холерными вибрионами
O139 серогруппы. Таким образом, к настоящему времени известны три
варианта возбудителя холеры: холерные вибрионы O1 серологической
группы - классические и эльтор (варианты Огава, Инаба, Гикошима) и
холерные вибрионы новой O139 серогруппы.
Наличие гена холерного токсина (ctx AB), независимо от его
экспрессии, отличает токсигенные (эпидемические) от
свободноживущих холерных вибрионов O1 и O139 серогрупп; кроме
того, в геноме токсигенных эпидемически значимых вариантов
присутствует ряд генов, кодирующих синтез белка ТОХ Т, передающего
сигналы запуска синтеза холерного токсина (СТ),
токсинкорегулируемых пилей адгезии (TCP) и фактора колонизации
(ACF). Известно, что свободноживущие атоксигенные холерные
вибрионы O1 чрезвычайно редко имеют tcp ген в своей хромосоме.
Характеристика генома выделенных штаммов молекулярно -
биологическими методами может быть использована для
эпидемиологического анализа и решения вопросов заноса,
распространения и укоренения инфекции.
Известно многообразие фенотипических изменений атоксигенных
холерных вибрионов, выделенных на свободных от холеры территориях,
а также распространение эпидемически значимых фагорезистентных
вариантов холерных вибрионов и штаммов с множественной
лекарственной устойчивостью.
4. ОРГАНИЗАЦИЯ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
Диагностические исследования на холеру в регламентированном
объеме могут проводить:
- бактериологические лаборатории территориальных центров
госсанэпиднадзора, лечебно - профилактических учреждений и
ведомственных служб, имеющие разрешение на работу с
микроорганизмами III группы патогенности;
- лаборатории особо опасных инфекций центров госсанэпиднадзора
в субъектах федерации (республиканских, краевых, областных,
городских), ведомственных учреждений, имеющие разрешение на
проведение диагностических исследований на холеру;
- лаборатории противочумных учреждений, имеющие разрешение на
проведение диагностических исследований на холеру и на работу с
возбудителем холеры.
Организация и выполнение диагностических исследований на
холеру в лабораториях должны осуществляться в соответствии с
требованиями, регламентирующими:
- безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп
патогенности и гельминтами - для бактериологических лабораторий
центров госсанэпиднадзора, лечебно - профилактических учреждений и
ведомственных служб;
- безопасность работы с микроорганизмами I-II групп
патогенности - для лабораторий особо опасных инфекций центров
госсанэпиднадзора ведомственных и противочумных учреждений;
- порядок учета, хранения, передачи и транспортирования
микроорганизмов I-IV групп патогенности;
Порядок получения лабораториями разрешения на работу с
микроорганизмами I-IV групп патогенности определяется действующими
нормативными документами о порядке выдачи разрешений на эти виды
работ.
Все диагностические лаборатории, выполняющие работы с
микроорганизмами I-IV групп патогенности, должны иметь лицензию на
деятельность, связанную с использованием возбудителей инфекционных
заболеваний.
В условиях осложнения эпидемиологической обстановки временное
разрешение на проведение диагностических исследований на холеру
бактериологическим лабораториям центров госсанэпиднадзора,
включенным в состав лабораторной службы очага, в случае расширения
их функциональных обязанностей, предоставляется решением
медицинского штаба очага.
4.1. При осуществлении эпидемиологического надзора
4.1.1. Бактериологические лаборатории центров
госсанэпиднадзора в городах и районах, учреждений лечебно -
профилактических и ведомственных служб:
- проводят плановые диагностические исследования на холеру
материала от больных острыми кишечными инфекциями, определенного
контингента здоровых лиц и проб из объектов окружающей среды в
объеме, предусмотренном для соответствующего типа территорий по
эпидпроявлениям холеры. Исследования ведут до установления
отрицательного результата анализа или до выделения культуры с
характерным для вибрионов ростом на агаровой и полиуглеводной
средах и положительной реакцией на оксидазу. Культуры проверяют на
чистоту в мазке, окрашенном по Граму, на подвижность и в реакции
агглютинации на стекле (далее слайд - агглютинации) с холерными
сыворотками O1, Огава, Инаба, РО и O139.
При положительном результате слайд - агглютинации немедленно
сообщают в территориальный центр госсанэпиднадзора, культуру для
окончательной идентификации немедленно доставляют в
специализированную лабораторию в установленном порядке.
При отрицательном результате слайд - агглютинации:
- культуру, выделенную от людей, направляют для дальнейшей
идентификации в специализированную лабораторию;
- неагглютинирующиеся культуры, выделенные из объектов
окружающей среды, идентифицируют на месте или по согласованию
передают в территориальный центр госсанэпиднадзора.
4.1.2. Лаборатории особо опасных инфекций центров
госсанэпиднадзора в республиках, краях, областях, городах и
ведомственных учреждений:
- выполняют диагностическое исследование материала от больных
и умерших с подозрением на холеру и проб из объектов окружающей
среды;
- идентифицируют культуры вибрионов, выделенных в
территориальных и ведомственных лабораториях, определяя их
таксономическую принадлежность, а также определяют эпидемическую
значимость (токсигенность) и антибиотикочувствительность холерных
вибрионов O1 и O139 серогрупп по регламентированным для
лабораторий тестам;
- осуществляют (или организуют) бактериологический контроль
качества питательных сред и других диагностических препаратов,
используемых в территориальных лабораториях;
- представляют оперативную информацию о выделении культур
холерных вибрионов O1 и O139 серогрупп;
- в установленном порядке немедленно передают в
территориальное противочумное учреждение культуры холерных
вибрионов, таксономическая принадлежность или токсигенность
которых имеющимися средствами диагностики не определяется;
- в течение 5 дней после окончания идентификации передают в
территориальное противочумное учреждение или головной по проблеме
"Холера" противочумный институт все культуры холерных вибрионов
O1, O139, независимо от объекта обследования, и других серогрупп
при выделении от больных;
- контролируют деятельность территориальных лабораторий,
оказывают им методическую помощь по всем вопросам лабораторного
обеспечения эпидемиологического надзора за холерой.
4.1.3. Лаборатории противочумных учреждений:
- проводят исследования материала от больных и умерших с
подозрением на заболевание холерой, а также проб из объектов
окружающей среды;
- подтверждают таксономическую принадлежность культур холерных
вибрионов, выделенных на курируемой территории;
- идентифицируют все атипичные культуры холерных вибрионов с
использованием дополнительных методов серологической,
биохимической и других видов идентификации с целью уточнения
таксономической принадлежности;
- определяют эпидемическую значимость (токсигенность) и
антибиотикочувствительность культур;
- осуществляют методическое руководство по всем вопросам
лабораторного обеспечения эпидемиологического надзора за холерой
на курируемой территории;
- в установленном порядке передают с паспортами выделенные
культуры холерных вибрионов в территориальный противочумный
институт, в головной по проблеме "Холера" - Ростовский-на-Дону
научно - исследовательский противочумный институт. Кроме того,
паспорта на эти же культуры направляют в Противочумный центр
Минздрава России.
Лабораторное обеспечение эпидемиологического надзора за
холерой осуществляют в соответствии с планом противохолерных
мероприятий, действующими нормативными и методическими
документами. Профилактические исследования на холеру проводят в
пределах рабочего дня с использованием соответствующих питательных
сред, диагностические исследования материала от подозрительных на
холеру больных (трупов) - в условиях круглосуточного режима работы
лаборатории.
4.2. При проведении противоэпидемических мероприятий
Организация и регламентирование деятельности лабораторий, а
также формирование лабораторной службы в очаге холеры
осуществляется в соответствии с действующими методическими
указаниями по вопросам профилактики холеры, организации
мероприятий и оценки противоэпидемической готовности медицинских
учреждений к проведению мероприятий на случай возникновения очага
холеры.
5. БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ
В системе противохолерных мероприятий значительное место
занимает бактериологический анализ, от правильности и
своевременности проведения которого зависит характер и объем
профилактических и противоэпидемических мероприятий.
Исследования проводят с целью:
- выявления больных холерой и вибриононосителей;
- установления окончательного диагноза при вскрытии трупов
лиц, умерших от подозрительного на холеру заболевания;
- обоснования выбора средств этиотропной терапии холеры;
- бактериологического контроля эффективности лечения больных
холерой и вибриононосителей;
- бактериологического контроля объектов окружающей среды, в
т.ч. поверхностных водоемов;
- бактериологического контроля эффективности обеззараживания в
очаге инфекции.
5.1. Отбор и доставка материала на исследование
Материалом для бактериологического анализа могут служить
испражнения, рвотные массы, желчь, трупный материал (отрезки
тонкого кишечника и желчный пузырь); предметы, загрязненные
испражнениями (постельное и нательное белье и др.); вода, ил,
гидробионты, сточные воды, содержимое выгребных туалетов; смывы с
объектов окружающей среды, пищевые продукты, мухи и др.
Материал от больного забирает медицинский персонал лечебного
учреждения немедленно после выявления больного и до начала лечения
антибиотиками. Руководитель несет ответственность за правильность
отбора, хранения и доставки проб в лабораторию.
Необходимо учитывать высокую чувствительность холерных
вибрионов к дезинфицирующим средствам и кислотам, возможность
антагонистического действия сопутствующей микрофлоры и
предполагаемую концентрацию возбудителя в исследуемом материале.
Если в материале от больных алгидной формой холеры концентрация
6 9
возбудителя достигает 10 -10 м.к./мл, то в испражнениях больных
легкой формой и леченных антибиотиками, реконвалесцентов
и носителей количество холерных вибрионов обычно не превышает
2 4
10 -10 м.к./г.
Для отбора проб используют чистую стерильную посуду, не
содержащую следов дезинфицирующих растворов. Стерилизацию посуды и
других средств забора материала проводят автоклавированием, сухим
жаром или кипячением в 2%-ном растворе пищевой соды.
Материал для исследования должен быть доставлен не позже чем
через 2 ч. после его взятия. В случае удлинения сроков доставки
используют транспортные среды. Наиболее удобной и достаточно
эффективной является 1%-ная пептонная вода (рН 8,4 +/- 0,1).
В пептонную воду в качестве ингибитора сопутствующей флоры
может быть добавлен теллурит калия из расчета 1:100000-1:200000
или моющее средство "Прогресс" в концентрации 0,1-0,2%. В
отдельных случаях для транспортирования материала могут быть
использованы солевые консерванты (см. раздел 7).
На флаконах (пробирках) с пептонной водой, передаваемых в
стационары для отбора проб, должна быть этикетка или надпись с
указанием названия среды и даты ее приготовления.
Среды во флаконах или пробирках, закрытых ватно - марлевыми
пробками, рекомендуется хранить не более 2 суток при температуре
не выше (10,0 +/- 0,2) град. С при условии сохранения их
стерильности. Целесообразно обеспечение стационаров и групп забора
проб средами в закатанных флаконах.
При наличии у больного диареи материал забирают до начала
этиотропной терапии в количестве 10-20 мл, у больных легкими
формами - 1-2 г испражнений. От больных тяжелой формой материал
направляют в лабораторию нативным и в 1%-ной пептонной воде. В
транспортную среду вносят 1-2 мл или 1-2 г материала на 5-6 мл
среды.
При вынужденном удлинении сроков доставки материала в
лабораторию (длительное плавание, круиз и т.п.) можно использовать
полоски фильтровальной (промокательной) бумаги. Жидкими
испражнениями пропитывают полоску обычной плотной промокательной
бумаги или другого гигроскопичного материала и герметично
упаковывают в пластиковый пакет для предохранения от высыхания при
транспортировании в лабораторию. На таких полосках холерные
вибрионы выживают до четырех - пяти или более недель, пока
сохраняется влага.
При обследовании на вибриононосительство материал забирает
медицинский персонал лечебно - профилактических учреждений, в
очаге - создают специальные группы по отбору проб, работающие под
руководством эпидемиологов.
Материал в количестве 1-2 г может быть доставлен на
исследование нативным, в 1%-ной пептонной воде или другой
транспортной среде.
5.1.1. Способы отбора проб от больных холерой,
вибриононосителей и контактных с ними лиц, секционного материала.
- Испражнения и рвотные массы в количестве 10-20 мл собирают в
стерильную посуду стерильными ложками или стеклянными трубками с
резиновой грушей из индивидуального судна, на дно которого
помещают меньший по размеру сосуд (лоток), удобный для
обеззараживания кипячением.
- Для взятия материала у больных с обильным водянистым стулом
можно использовать резиновый катетер, один конец которого вводят в
прямую кишку, а другой опускают в банку. Жидкие испражнения
стекают в сосуд свободно или при легком массаже брюшной стенки.
- Стерильный ректальный ватный тампон из гигроскопической ваты
вводят в прямую кишку на глубину 5-6 см и собирают им содержимое
со стенок кишечника. Тампон опускают во флакон или пробирку с
1%-ной пептонной водой, обломив часть деревянного стержня.
- Стандартную стерильную петлю из алюминиевой проволоки перед
забором материала смачивают стерильным 0,9%-ным раствором натрия
хлорида и вводят в прямую кишку на 8-10 см. Взятый материал
переносят во флакон или пробирку с 1%-ной пептонной водой.
- Желчь берут при дуоденальном зондировании в лечебном
учреждении. В отдельные пробирки собирают две порции: из желчного
пузыря и желчных протоков (В и С). Материал доставляют нативным.
- От умерших с подозрением на холеру берут отрезки (длиной
около 10 см) верхней, средней и нижней частей тонкой кишки, разрез
производят между двойными лигатурами, предварительно наложенными
на оба конца изымаемого участка кишечника. Желчный пузырь после
перевязки протока извлекают целиком. Содержимое кишечника и желчь
от трупа можно взять стерильным шприцем с толстой иглой в объеме
до 10 мл и перенести в емкость с 1%-ной пептонной водой. Взятые
образцы органов трупа укладывают раздельно в стерильные банки.
Банки, пробирки с материалом закрывают непромокаемыми пробками
и пергаментной бумагой, тщательно обрабатывают снаружи салфеткой,
смоченной дезинфицирующим раствором, избегая затекания его внутрь.
Все пробы этикетируют, укладывают в специально подготовленную для
транспортирования металлическую тару и перевозят на служебном
транспорте с сопровождающим. Форма направления дана в прилож. 1.
5.1.2. Отбор проб из объектов окружающей среды.
- Воду (питьевую, из поверхностных водоемов и др.) для
исследования берут в количестве 1 л на одну пробу в двух объемах
по 500 мл в стерильную посуду с непромокаемой пробкой.
Из водопроводных кранов пробы воды берут после
предварительного обжигания их спиртовым факелом и спуска воды в
течение 10 мин. при полном открытии крана.
- Хозяйственно - бытовые сточные воды отбирают для
исследования двумя способами: в объеме 1 л также в двух емкостях
по 500 мл или тампонами, приготовленными из марлевых салфеток
размером 10x10 см, сложенных в 10-15 слоев. Последние закрепляют у
места забора воды, через сутки помещают в стерильную банку и
доставляют в лабораторию.
- Гидробионтов (рыб, лягушек и др.) отлавливают из водоемов
любым способом и в закрытых банках, ведрах и других сосудах
доставляют в лабораторию.
Исследовать зоопланктон (дафнии, циклопы и др.) можно
групповым методом, объединяя в один посев 10-30 образцов,
отловленных на одном участке водоема. В этом случае они могут быть
доставлены в одном сосуде. При исследовании рыб берут содержимое
желудка и жабры.
- Смывы с различных объектов окружающей среды берут ватным или
марлевым тампоном, смоченным 0,9%-ным раствором натрия хлорида, с
поверхности площадью 10x10 см. Тампон опускают во флакон или
пробирку с 1%-ной пептонной водой.
- Для сбора мух расставляют мухоловки, в которые наливают
1%-ную пептонную воду с 1% сахара.
- Остатки пищи в очаге и по показаниям пищевые продукты
отбирают по 200 г плотных и 0,5 л жидких, помещают в стеклянную
посуду и закрывают. При необходимости в жидкие продукты добавляют
основной пептон до 1%-ной концентрации.
Пробы объектов окружающей среды этикетируют, заполняют
направление (прилож. 2) и отправляют в лабораторию с нарочным
согласно действующим СП.
Перечень предметов, входящих в укладки для отбора проб, см. в
прилож. 3, 4.
5.2. Порядок исследования
При бактериологическом исследовании на холеру используют
различные питательные среды: жидкие среды обогащения, щелочной
агар, элективные дифференциально - диагностические среды и набор
сред для идентификации.
Применяют сухие среды производственного выпуска, имеющие
номера госрегистрации и лицензии, или среды, консерванты,
приготовленные по рецептуре и технологии, изложенной в разделе 7.
Перечень производственных питательных сред и диагностических
препаратов для выделения и идентификации возбудителя холеры
приведен в прилож. 5. При транспортировании и хранении медицинских
иммунобиологических препаратов следует руководствоваться
СП 3.3.2.028-95. Используемые для диагностики холеры питательные
среды подлежат бактериологическому контролю в установленном
порядке.
Агаровые среды перед использованием должны быть тщательно
подсушены. Посев делают так, чтобы получить рост в виде
изолированных колоний. Все посевы инкубируют при температуре
(37,0 +/- 0,5) град. С.
Посевы исследуемого материала на всех этапах выращивают в
1%-ной пептонной воде 6-8 ч., в пептонной воде с теллуритом калия
- 12-18 ч., на щелочном агаре - не менее 14-16 ч., а на плотных
элективных средах - 18-24 ч. Теллурит калия следует добавлять в
1%-ную пептонную воду с рН не ниже 8,3 +/- 0,1, до внесения
исследуемого материала. Продолжительность хранения рабочего
раствора теллурита калия (1:1000) - 7 дней, а питательных сред с
теллуритом калия - не более 2 суток при условии содержания их в
холодильнике.
5.2.1. Исследование проб от больных и вибриононосителей,
секционного материала (рис. 1).
I этап
Испражнения, рвотные массы больных, а также содержимое
кишечника, желчного пузыря и суспензию кусочков слизистой тонкого
кишечника трупа в объеме 0,5-1,0 мл засевают пипеткой в 50-100 мл
накопительной среды, петлей - на щелочной агар и одну из
элективных сред (СЭДХ, TCBS).
При исследовании материала от больных с подозрением на
заболевание холерой, не допускается использование 1%-ной пептонной
воды с теллуритом калия в качестве накопительной среды.
В случае поступления материала от больных с подозрением на
холеру целесообразно применять ускоренные методы исследования:
иммунолюминесцентный, иммобилизацию и ПЦР со специфическими
праймерами (см. раздел 6).
Материал от подозреваемых на вибриононосительство засевают в
50 мл среды накопления при индивидуальных анализах и в 100 мл -
при групповых, объединяя в один флакон по 0,5-1,0 мл пробы не
более чем от 5 человек. К групповым посевам прибегают в редких
случаях при проведении массовых обследований на
вибриононосительство.
Материал, доставленный в 5 мл 1%-ной пептонной воды, полностью
используют для посева в 50 мл среды накопления. В случае
поступления в лабораторию материала, забранного в 50 мл 1%-ной
пептонной воды во флаконе, и доставки его не позже 2 ч. после
забора пробы, флакон помещают в термостат на 6 ч. для накопления
возбудителя. При доставке материала в более поздние сроки 5 мл его
засевают в 50 мл 1%-ной пептонной воды.
В отдельных случаях, при бактериологическом исследовании
материала от лиц, принимавших антибиотики, активные по отношению к
возбудителю холеры, его засевают в 200-300 мл 1%-ной пептонной
воды (предпочтительно в широкогорлые колбы) и на 2 чашки щелочного
агара так, чтобы получить рост в виде изолированных колоний.
Посевы инкубируют при 37 град. С в течение 24 ч., производя
последовательные высевы через 8-10 ч. инкубации с поверхностного
слоя среды на пластинки щелочного агара. Использование второй
среды обогащения в этом варианте исследования нецелесообразно.
II этап (через 6-8 ч. от начала исследования).
С первой среды накопления делают высев на щелочной агар и одну
из элективных сред и в 5-8 мл второй среды накопления. Пересевы в
жидкие и на плотные среды делают с поверхности жидкой среды
большой бактериологической петлей диаметром 5 мм.
При отрицательных результатах исследования нативного материала
ускоренными методами, их повторяют после 6 ч. инкубации первой
среды накопления.
III этап (через 12-16 ч. от начала исследования).
Высев со второй среды накопления на щелочной агар.
В случае необходимости ускорения хода анализа материала от
больного или подозрительного на заболевание холерой, отбор колоний
со щелочного агара, засеянного в начале исследования, можно
начинать уже на этом этапе, в остальных случаях - на следующем.
Рис. 1. Схема лабораторного исследования на холеру
-----------------------------------------------------------------¬
¦ Исследуемый материал ¦
L------T---------T-------------------------------------T----------
¦ ¦ ¦
¦ ¦ ¦
\/ \/ \/
-------¬ ----T------------------------>--------------------¬
¦ЩА, ЭС¦ ¦ I ¦ -----¬ ¦Ускоренные методы: ¦
L--T---- L-T-+------->¦ II +---------->¦ - МФА ¦
¦ ¦ L-T--- ¦ - РИВ ¦
¦ \/ ¦ ¦ - РНГА ¦
¦ -------¬ \/ ¦ - ПЦР ¦
¦ ¦ЩА, ЭС¦ -----¬ L--------------------
¦ L---T--- ¦ ЩА ¦
¦ ¦ L-T---
¦ ¦ ¦
¦ ¦ ¦
\/ \/ \/
--------------------------------------¬
¦ - отбор колоний ¦
¦ - высев подозрительных колоний на ЩА¦
¦ и ПУС ¦
L-------------------------------T------
¦
\/
---------------------------¬
¦Отбор культур по ПУС и ОП ¦
L--------------------T------
¦
\/
-----------T-----------T---------T-------------T------------¬
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
\/ \/ \/ \/ \/ \/
-----¬ ---------¬ --------¬ -----¬ -----¬ -----¬
¦ПУС+¦ ¦ПУС+ <*>¦ ¦ОП+ <*>¦ ¦ПУС-¦ ¦ПУС-¦ ¦ПУС+¦
¦ОП+ ¦ L--------- L-------- ¦ОП+ ¦ ¦ОП- ¦ ¦ОП- ¦
L-T--- L--T-- L-T--- L-T---
¦ ¦ ¦ ¦
L---------------T------------------ \/ \/
¦ --------¬ -------¬
\/ ¦Не ис- ¦ ¦Иссле-¦
------------------------------¬ ¦следуют¦ ¦дуют ¦
---+ ОРА с сыворотками O1 и O139 +---------¬ L-------- ¦на ки-¦
¦ +L------------------------------ - ¦ ¦шечную¦
¦ ¦ ¦группу¦
¦ ¦ L-------
¦ ¦
\/ \/
--------------------------------------¬ -----------------------¬
¦Сокращенная схема идентификации: ¦ ¦Определение ¦
¦- морфология и подвижность микробных ¦ ¦принадлежности к роду ¦
¦клеток ¦ ¦Vibrio, виду ¦
¦- ОП ¦ ¦V. cholerae или другим¦
¦- O/F тест и отношение к отдельным ¦ ¦видам патогенных ¦
¦углеводам (табл. 4) ¦ ¦вибрионов ¦
¦- МФА ¦ L-----------------------
¦- РИВ ¦ -----------------------¬
¦- РА с сыворотками O1, Инаба, Огава, ¦ ¦Условные обозначения: ¦
¦РО или слайд - агглютинация с O139 ¦ ¦I и II - среда ¦
¦- чувствительность к фагам холерным ¦ ¦накопления; ЩА - ¦
¦классическому и эльтор ¦ ¦щелочной агар; ЭС - ¦
¦Дополнительные признаки биовара ¦ ¦элективная среда для ¦
¦V. cholerae: ¦ ¦выделения холерных ¦
¦- гемагглютинация ¦ ¦вибрионов; ПУС - ¦
¦- чувствительность к полимиксину В ¦ ¦полиуглеводная среда; ¦
¦50 ЕД./мл ¦ ¦ОП - оксидазная проба;¦
¦- реакция Фогес - Проскауэра ¦ ¦ОРА - ориентировочная ¦
¦Определение антибиотикограммы ¦ ¦реакция агглютинации; ¦
¦Оценка эпидемической значимости: ¦ ¦РА развернутая реакция¦
¦- гемолитическая активность по Грейгу¦ ¦агглютинации; МФА - ¦
¦- чувствительность к фагам холерным ¦ ¦метод флюоресцирующих ¦
¦эльтор cts+ и ctx- ¦ ¦антител; РИВ - реакция¦
¦- ПЦР, ДНК-зондирование ¦ ¦иммобилизации ¦
¦- токсигенность на кроликах - ¦ ¦вибрионов; РНГА - ¦
¦сосунках ¦ ¦реакция непрямой ¦
¦Уточнение родовой и видовой ¦ ¦гемагглютинации; ПЦР -¦
¦принадлежности атипичных культур по ¦ ¦полимеразная цепная ¦
¦расширенному набору признаков ¦ ¦реакция; ¦
¦(табл. 2, 3) ¦ ¦<*> в случае отбора ¦
L-------------------------------------- ¦колоний только на ПУС ¦
¦или ЩА. ¦
L-----------------------
IV этап (через 18-24 ч. от начала исследования).
Отбор подозрительных на холерный вибрион колоний в посевах на
плотные среды нативного материала, а также в высевах из 1-й и 2-й
накопительных сред.
- Чашки с посевами просматривают в проходящем свете
невооруженным глазом или с помощью лупы, а также (особенно в
вечернее и ночное время) под стереоскопическим микроскопом в косо
проходящем свете и отбирают подозрительные на вибрионы колонии для
выделения и идентификации культуры.
На щелочном агаре колонии холерных вибрионов O1 и O139
серогрупп в типичной S-форме - круглые, гладкие, плоские,
голубоватые, гомогенные, с ровными краями, прозрачные в проходящем
свете и светло - серые с голубым или зеленоватым оттенком под
стереоскопическим микроскопом в косо проходящем свете (прилож. 6).
Колонии холерных вибрионов на элективных средах TCBS и СЭДХ
имеют ярко - желтую окраску на зеленом или синем фоне среды,
полупрозрачные. Размеры колоний на щелочном агаре через 10-12 ч.
инкубации обычно не превышают 1 мм, а к 18-24 ч. достигают 2-3 мм
в диаметре. Темпы формирования колоний холерных вибрионов на
элективных средах несколько замедлены, поэтому просмотр посевов на
СЭДХ или TCBS следует проводить не ранее чем через 18-20 ч.
инкубации, когда размеры их становятся близки к колониям,
вырастающим на щелочном агаре.
В отдельных случаях в посевах могут также встречаться
атипичные колонии: мутные с плотным центром, пигментированные
(коричневые или светло - желтые), мельчайшие коккоподобные,
шероховатые.
Следует иметь в виду, что состав и качество питательных сред
оказывают влияние на величину и плотность колоний холерных
вибрионов, а также на морфологию клеток.
- При отборе колоний можно использовать пробу на
индофенолоксидазу с однокомпонентным реактивом (без альфа-нафтола)
или с индикаторными бумажками из набора СИБ-1 для идентификации
вибрионов. С колониями, обнаруженными на элективных средах, пробу
на оксидазу ставить не рекомендуется.
- Подозрительные колонии проверяют в слайд - агглютинации с
сывороткой холерной O1 в разведении 1:50-1:100. При положительной
реакции и достаточном количестве подозрительных колоний ставят
слайд - агглютинацию с варианто - специфическими сыворотками Инаба
и Огава в том же разведении, приготавливают мазки для окраски по
Граму и обработки флюоресцирующими иммуноглобулинами. При
отрицательных результатах колонии, обнаруженные в посевах
материала от больных, проверяют в слайд - агглютинации с холерными
сыворотками O139 и РО.
Положительная ориентировочная реакция агглютинации с холерной
O1 сывороткой в разведении 1:100 и варианто - специфической в
разведении 1:50 или положительная реакция с флюоресцирующими
иммуноглобулинами в сочетании с морфологическими, культуральными
признаками и специфической иммобилизацией позволяют выдать на
соответствующем этапе предварительный ответ об обнаружении в
исследуемом материале холерного вибриона O1, а в случае
положительной реакции с сывороткой O139 - холерного вибриона O139
серогруппы.
- Подозрительные на вибрионы колонии, агглютинирующиеся и не
агглютинирующиеся холерными O1 и O139 сыворотками, отсевают на
одну из полиуглеводных сред (лактозосахарозная, Ресселя, Клиглера,
маннозосахарозная или др.) и (или) на сектор пластинки щелочного
агара для выделения чистой культуры, ее идентификации и
определения чувствительности к антибиотикам.
V этап (через 24-36 ч. от начала исследования).
Отбор культур для идентификации.
На полиуглеводных средах отбирают культуры с типичными для
вибрионов характером роста и изменениями:
- на двууглеводных средах (лактозосахарозная, глюкозолактозная
и Клиглер) наблюдается характерное для кислой реакции изменение
цвета столбика при сохранении цвета скошенной части без
образования газа, а также сероводорода, улавливаемого в среде
Клиглера;
- в маннозосахарозной среде за счет ферментации обоих
углеводов окрашиваются и столбик, и скошенная часть, а также
улавливается образование сероводорода.
Культуры, выросшие на щелочном агаре, проверяют на наличие
индофенолоксидазы.
Определяют морфологию микроорганизмов и чистоту отобранных
культур, выросших на щелочном агаре и полиуглеводных средах, с
помощью окрашенных по Граму мазков.
Культуры, дающие характерные изменения на полиуглеводных
средах и положительные в пробе на оксидазу, проверяют в
ориентировочной слайд - агглютинации с холерными сыворотками O1 в
разведении 1:100, РО, Инаба и Огава - в разведении 1:50. При
отрицательных результатах с этими сыворотками ставят слайд -
агглютинацию с холерной сывороткой O139 серогруппы, используя ее в
соответствии с инструкцией по применению.
На основании положительных результатов агглютинации с
сыворотками O1, Инаба или / и Огава выдают предварительный
положительный ответ о выделении из исследуемого материала культуры
холерного вибриона O1 соответствующего серовара.
Если выделенная культура реагирует с холерной сывороткой O139
при отрицательных результатах с сыворотками O1 серогруппы, выдают
ответ о выделении холерного вибриона O139 серогруппы.
Проводят идентификацию выделенных на полиуглеводных средах или
на щелочном агаре агглютинирующихся и не агглютинирующихся
сыворотками O1, РО или O139 серогрупп оксидазопозитивных культур
по сокращенной или полной схеме.
VI этап (через 36-48 ч. от начала исследования).
Учитывают результаты идентификации и выдают окончательный
ответ о выделении культуры холерного вибриона соответствующей
серогруппы и биовара.
Для холерных вибрионов O1 эпидемическую значимость оценивают
по тестам гемолитической активности и чувствительности к фагам
эльтор ctx+ и ctx-, а в специализированных учреждениях - по
результатам ПЦР или генетического зондирования на присутствие в
геноме выделенной культуры ctx AB гена, а также токсигенности на
модели кроликов - сосунков. Эпидемическую значимость холерных
вибрионов O139 серогруппы определяют по тем же тестам, кроме
чувствительности к фагам эльтор ctx+ и ctx-. К окончанию этого
этапа исследования должна быть определена
антибиотикочувствительность выделенной культуры.
При выделении от больного или вибриононосителя культуры
холерного вибриона, не агглютинирующейся холерными сыворотками O1
и O139, выдают ответ о выделении холерных вибрионов не O1 и не
O139. При наличии вибрионных агглютинирующих диагностических
сывороток определяют принадлежность к другим серогруппам (О2-О83).
Идентификацию культур, агглютинирующихся РО-сывороткой, см. в
разделе 5.3.
5.2.2. Исследование объектов окружающей среды.
Схема анализа объектов окружающей среды отличается от схемы
исследования материала от больных только на I этапе, II-VI этапы
изложены выше.
Вода поверхностных водоемов и водопроводная
В зависимости от времени доставки пробы возможны следующие
варианты посевов с целью первичного накопления вибрионов:
- к исследуемой воде добавляют раствор основного пептона до
1%-ной концентрации, определяют рН, в случае необходимости
подщелачивают 10%-ным раствором едкого натрия до рН 8,4 +/- 0,1.
Время инкубации в 1-й среде накопления - 8-10 ч. Объем 2 среды
накопления - 10 мл; время инкубации в среде без теллурита калия 6
ч., а с теллуритом калия - 18-20 ч.;
- в исследуемую воду добавляют раствор основного пептона до
1%-ной концентрации и теллурит калия из рабочего разведения 1:1000
до концентрации 1:100000 или 1:200000 в соответствии с данными
проверки. Устанавливают рН - 8,4 +/- 0,1. Время инкубации 18-24
ч.; вторая среда накопления - 10 мл среды без теллурита калия,
время инкубации 6-8 ч.;
- исследование проб воды можно также проводить с
использованием в качестве ингибитора посторонней флоры моющего
средства "Прогресс" в концентрации 0,1-0,2%;
- после добавления основного раствора пептона до 1%-ной
концентрации и установления щелочной реакции, пробы сохраняют при
комнатной температуре (не выше 25 град. С) до утра (первая среда
накопления). В начале следующего дня засевают 5 мл поверхностного
слоя в 100 мл 1%-ной пептонной воды (вторая среда накопления) и
делают высев на щелочной агар; высев со второй среды накопления
производят через 6-8 ч. инкубации;
- воду фильтруют через мембранные фильтры N 2 или 3, смыв с
которых сеют в накопительную среду и на агаровые пластинки. Из
смыва с фильтра можно делать мазки для окраски флюоресцирующими
холерными иммуноглобулинами, а также ставить РНГА, ПЦР со
специфическими праймерами.
При интенсивном бактериальном загрязнении проб можно
использовать III среду накопления.
Хозяйственно - бытовые сточные воды
Сточные воды, доставленные в объеме 1 л, фильтруют через
бумажный или матерчатый фильтр для освобождения от механических
примесей (при необходимости).
После добавления к пробам основного раствора пептона до 1%-ной
концентрации устанавливают рН 8,4 +/- 0,1 и инкубируют в объемах
по 500 мл 8-10 ч. (1 среда накопления) или с добавлением теллурита
калия 1:100000 (1:200000) - 18-24 ч.
При заборе сточных вод марлевыми тампонами, последние помещают
в широкогорлые колбы или банки с накопительной средой (500 мл) и
далее исследуют, как указано выше.
Гидробионты
Лягушку непосредственно перед исследованием обездвиживают
уколом иглы в спинной мозг и фиксируют на препаровальной доске
брюшком вверх. Поверхность брюшка обрабатывают спиртом и ножницами
делают медиальный разрез. Желчный пузырь отсекают от печени,
разрезают и делают отпечаток на пластинке щелочного агара. Остатки
желчи вместе с желчным пузырем помещают во флаконы с 50-100 мл
1%-ной пептонной воды. Содержимое желудка засевают в 1%-ную
пептонную воду, а внутренней поверхностью стенки делают отпечатки
на агаровые пластинки. Посев кишечника делают таким же образом,
отсекая несколько петель в верхнем, среднем и нижнем отделах
кишечника.
У крупных рыб в том же порядке засевают в накопительную среду
содержимое желчного пузыря, желудка, кишечника и жабры. Мелких рыб
(мальков) измельчают ножницами по 10-20 экз. в одной пробе и
делают посев суспензии петлей на чашку с агаром и в 1%-ную
пептонную воду.
Дафний, циклопов и др. рачков растирают в ступке и засевают
петлей в 1%-ную пептонную воду.
У раков исследуют кишечник и жабры, делая посев содержимого в
среду накопления, и слизистой стенки - отпечатком на агаровую
среду.
Пищевые продукты
Безалкогольные напитки исследуют тем же методом, что и воду.
Молоко в количестве 5 мл сеют в 50-100 мл среды накопления или
к 0,5 л молока добавляют основной раствор пептона до 1%-ной
концентрации его в молоке. Другие молочные продукты (кефир,
сметану, творог, мороженое и т.д.) в количестве 5-10 мл засевают в
1%-ную пептонную воду.
|
