|
Стр. 3
5. Пипетки.
6. Чашки Петри.
7. Палочки стеклянные или деревянные.
8. Микроскоп.
Подготовка к работе
Желчь в лабораторию должна быть доставлена сразу после
зондирования. При подозрении на лямблиоз, стронгилоидоз,
анкилостомоз, трихостронгилез тщательно исследуют порцию "А",
исследование порций "Б" и "С" более информативно на печеночные
трематодозы.
В желчи, исследуемой сразу после зондирования, обычно
обнаруживаются вегетативные подвижные формы лямблий и подвижные
личинки стронгилоидеса. При исследовании желчи через несколько
часов после зондирования (но в день забора материала) обычно
подвижность личинок стронгилоидеса и вегетативных форм лямблий не
наблюдается.
Ход исследования
5.1.1. Исследования нативного мазка желчи
- Выбрать сгустки слизи, волокон, патологические примеси.
- Палочкой стеклянной или деревянной (можно пипеткой) нанести
тонким слоем желчь на предметное стекло (мазок не должен стекать с
предметного стекла).
- При исследовании в чашке Петри налить желчь тонким слоем на
дно чашки.
- Микроскопировать без покровного стекла при увеличении:
объектив х 8 или х 10, окуляр х 10; для уточнения морфологии яиц
гельминтов и для исследования на простейших - объектив х 40.
Для обнаружения подвижных личинок стронгилоидеса можно
микроскопировать в чашках Петри под стереомикроскопом МБС (окуляр
х 2; объектив х 12,5-14).
5.1.2. Исследования желчи с центрифугированием
- При наличии в желчи большого количества слизи или гноя
взболтать все порции с равным количеством эфира.
- Центрифугировать в центрифужных пробирках все порции
дуоденального содержимого не менее 20 мин при 1500-2000 об/мин.
- Надосадочную часть желчи слить в отдельную емкость.
- Осадок перенести пипеткой или прямо из пробирки на
предметное стекло.
- Микроскопировать без покровного стекла при увеличении:
объектив х 8 или х 10, окуляр х 10; и для уточнения морфологии яиц
гельминтов и для исследования на простейших - объектив х 40.
Для обнаружения подвижных личинок стронгилоидеса можно
микроскопировать в чашках Петри под стереомикроскопом МБС (окуляр
х 2; объектив х 12,5-14).
Эффективность метода
- Наиболее эффективно сочетание исследования желчи нативно и с
центрифугированием.
- Исследование желчи на яйца трематод эффективно только при
центрифугировании.
Применение метода
- Для выявления яиц трематод (описторхиса, клонорха, фасциол,
дикроцелий), вегетативных и цистных форм простейших - лямблий,
личинок стронгилоидеса, трихостронгилид и анкилостомид.
5.2. Исследование мокроты, промывных вод бронхов,
лаважной жидкости
5.2.1. Исследование мокроты
Необходимые реактивы и оборудование:
1. Раствор NaOH или КОН 0,5%-ный.
2. Центрифужные пробирки.
3. Предметные стекла, большие предметные стекла.
4. Центрифуга.
5. Микроскоп.
Подготовка к работе
Мокроту, представляющую собой патологический секрет
дыхательных путей вместе с отделяемым носоглотки и полости рта,
собрать в стерильную (можно прокипяченную) стеклянную емкость с
крышкой и исследовать сразу после доставки в лабораторию.
Исследуется мокрота, выделенная при откашливании (не слюна и
не слизь с носоглотки).
При слизисто - гнойной мокроте для лучшего растворения слизи,
гноя:
- мокроту смешать с равным объемом 0,5%-ного раствора едкой
щелочи;
- слегка подогреть пробирку на водяной бане;
- пробирку энергично встряхивать в течение 5 мин.
5.2.1.1 Исследование нативного мазка мокроты
Ход исследования:
- Мокроту из стеклянной емкости пипеткой переносят на
предметное стекло (лучше большое).
- Приготовить мазок путем равномерного растирания между двумя
предметными стеклами или нанесения и равномерного растирания
палочкой на большом предметном стекле.
- Микроскопировать при увеличении: объектив х 8 или х 10,
окуляр х 10, для уточнения морфологических особенностей окуляр х
40.
5.2.1.2. Исследование мокроты с центрифугированием
Ход исследования:
- Перелить мокроту в центрифужные пробирки.
- Центрифугировать в течение 3-5 мин при 1500 об/мин.
- Слить надосадочную жидкость.
- Перенести осадок пипеткой или сразу из пробирки на
предметное стекло.
- Микроскопировать при увеличении: объектив х 8 или х 10,
окуляр х 10, для уточнения морфологических особенностей окуляр х
40.
Эффективность метода:
- Эффективен для выявления яиц гельминтов, паразитирующих в
легких, бронхах (яйца парагонимуса, томинкса), иногда яиц
шистосом.
- Менее эффективен при диагностике личиночных стадий кишечных
нематод в период миграции через легкие (личинки аскарид,
анкилостомид, стронгилоидеса).
- Иногда можно обнаружить личиночные стадии эхинококков
(сколексы эхинококка, альвеококка) при поражении легких и прорыве
пузырей в бронх.
Применение метода
- Для диагностики легочных гельминтозов.
5.2.1.3. Исследование окрашенных мазков на пневмоцистоз
Необходимые реактивы и оборудование
Химреактивы
1. Для приготовления мазков - муколитики (0,3%-ный
дитиотреитол в 0,02 М ЭДТА, рН=7,0) или ацетилцистеин, или 4%-ный
р-р NaOH; формалин, спирт.
2. Для окраски мазков по Романовскому - Гимзе - смесь
Никифорова; сульфатно - уксусный реагент (45 мл ледяной уксусной
кислоты и 15 мл концентрированной серной кислоты) -10%-ная краска
Романовского - Гимзы в фосфатном буфере рН=7,2.
3. Для окраски мазков толуидиновым синим - толуидиновый синий
0,15%-ный (75 мг толуидинового синего + 15 мл дистиллированной
воды + 0,5 мл концентрированной соляной кислоты + 35 мл
абсолютного спирта); водный метиловый желтый 0,25%-ный.
4. Для окраски по Гомори - Грохотту - формалин 10%-ный;
дистиллированная вода; раствор хромовой кислоты (5 г
хромовокислого оксида + 95 мл дистиллированной воды), 1%-ный
раствор метабисульфита калия (или натрия); рабочий раствор серебра
(100 мл водного 3%-ного раствора метенамина или уротропина + 5 мл
водного 5%-ного нитрата серебра) - готовится непосредственно перед
употреблением; 5%-ный водный тетраборат натрия (бура);
диметилсульфоксид; раствор хлорного золота 0,2%-ный; водный
раствор тиосульфата соды 2%-ный; лихтгрюн (0,02 г лихтгрюна + 100
мл дистиллированной воды + 5 капель ледяной уксусной кислоты).
5. Для окраски акридиновым оранжевым - маточный раствор: 100
мл акридина оранжевого растворяют в 100 мл дистиллированной воды,
рабочий раствор готовится при разведении маточного раствора в
10-100 раз физиологическим раствором, абсолютный метанол (получают
обезвоживанием с помощью окиси кальция с последующей
дистилляцией).
Оборудование
1. Центрифужные пробирки
2. Стеклянные палочки
3. Предметные стекла
4. Термостат
5. Центрифуга
6. Микроскоп
Подготовка к работе
- Мокроту или другой материал рекомендуется исследовать
немедленно. В исключительных случаях возможно временное сохранение
лаважной жидкости с помощью консервации:
а) лаважную жидкость слить в стоящую во льду посуду с 50 мл
раствора Хенкса коммерческого, рН=7,2-7,4;
б) лаважную жидкость заморозить до -4 град. С.
- Подготовка предметных стекол: желательно использовать
альбуминизированные стекла.
Ход исследования
Приготовление мазков мокроты:
- Поместить мокроту в центрифужную пробирку.
- Добавить равное количество муколитика.
- Полученную смесь быстро перемешать.
- Поместить в термостат при температуре 37 град. С на 5-15
мин.
- Развести смесью формалина и спирта (1:1).
- Центрифугировать 10 мин при 1500 об/мин.
- Слить надосадочную жидкость.
- Осадок перенести на 4-8 предметных стекол.
- Осадок нанести на стекло в виде тонкого мазка.
- Мазок высушить на воздухе.
Приготовление мазков лаважной жидкости:
- Поместить лаважную жидкость в центрифужную пробирку.
- Добавить равное количество 50 градусного спирта и
перемешать.
- Центрифугировать 20 мин при 2500 об/мин.
- Слить надосадочную жидкость.
- Осадок перенести на 4-8 предметных стекол.
- Осадок нанести на стекло в виде тонкого мазка.
- Мазок высушить на воздухе.
Окраска мазков
A) Скрининговая окраска по Романовскому - Гимзе
- Высушенный мазок фиксируют в смеси Никифорова в течение
10-15 мин.
- Опустить мазок в сульфатно - уксусный реагент на 10 мин.
- Промывать проточной водой в течение 5 мин.
- Высушить мазок на воздухе.
- Окрашивать 10%-ной краской Романовского - Гимзы в течение 30
мин.
Результат: цитоплазма трофозоитов голубоватая, ядро - розовое,
внутрицистные тельца имеют фиолетовое ядро.
Б) Окончательная или специфическая окраска толуидиновым синим
- Высушенный мазок фиксируют в 10%-ном растворе формалина.
- Промыть дистиллированной водой.
- Опустить мазок в сульфатно - уксусный реагент на 5 мин.
- Реагент перемешать стеклянной палочкой.
- Оставить мазок в сульфатно - уксусном реагенте еще на 10
мин.
- Промыть проточной водой.
- Высушить мазок на воздухе.
- Окрашивать 0,15%-ным толуидиновым синим в течение 3 мин.
- Промыть проточной водой.
- Высушить мазок на воздухе.
- Докрашивать в 0,25%-ном растворе водного метанилового
желтого в течение 2 мин.
- Промыть водой.
Результат: четко дифференцируется стенка пневмоцист, но не
дает представления о клеточном содержимом; цисты сине -
фиолетовые, тканевые элементы и фон - зелено - желтые.
B) Окончательная или специфическая окраска по Гомори - Грохоту
- Высушенные мазки фиксируют в 10%-ном растворе формалина в
течение 5-10 мин.
- Промыть дистиллированной водой.
- Быстро подогреть раствор хромовой кислоты в стакане до 65
град. С.
- В нагретый раствор быстро погрузить мазки на 1 мин.
- Промыть дистиллированной водой.
- Опустить мазки в 1%-ный раствор метабисульфита калия на 1
мин.
- Приготовить раствор: 25 мл рабочего раствора серебра + 25 мл
дистиллированной воды +2 мл 5%-ного водного тетрабората натрия +
15 мл диметилсульфоксида.
- Опустить мазки в приготовленный раствор.
- Подогреть до 90-95 град. С, пока мазки не станут темно -
коричневыми, а раствор светло - серым.
- Прополоскать мазки в трех сменах дистиллированной воды.
- Опустить мазки в 0,2%-ный водный раствор тиосульфата соды на
1 мин.
- Промыть дистиллированной водой.
- Окрашивать лихтгрюном в течение 5 мин.
- Промыть дистиллированной водой.
Результат: цисты светло- или темно - коричневые (цвет зависит
от толщины мазка), округлой или чашеобразной формы, окружающий фон
и тканевые элементы зелено - желтые.
Г) Окраска акридином оранжевым.
- Высушенные мазки фиксируют в абсолютном метаноле в течение 2
мин.
- Окрасить рабочим раствором акридина оранжевого 10 мин.
- Промыть дистиллированной водой.
- Высушить окрашенные мазки на воздухе.
- Микроскопировать под масляной иммерсией при увеличении:
объектив х 90 или х 100, окуляр х 7 или х 10.
Эффективность метода
- Метод эффективен при условии немедленного исследования
материала и использования двух вариантов окрашивания параллельно.
Применение метода
- Метод применяют для диагностики пневмоцистоза.
- Другой материал на пневмоцистоз (слизь из горла и гортани,
аспираты из бронхов, биоптаты и мазки - отпечатки легочной ткани)
исследуется так же, как и мокрота.
5.3. Микроскопические исследования мочи
Необходимое оборудование:
1. Центрифужные пробирки.
2. Стеклянные палочки.
3. Пипетки.
4. Предметные стекла.
5. Центрифуга.
6. Микроскоп.
5.3.1. Метод концентрации
Ход исследования:
- Всю разовую порцию мочи отстаивать в высоких банках или
цилиндрах в течение 30-45 мин.
- Слить верхнюю часть, оставив 10-15 мл осадка, который
перелить в центрифужные пробирки.
- Оставшуюся часть центрифугировать в течение 5 мин при 1500
об/мин, или 1-2 мин при 3000 об/мин.
- Слить надосадочную жидкость.
- Осадок перенести пипеткой на предметное стекло.
- Микроскопировать без покровного стекла: объектив х 8 или х
10, окуляр х 10.
Эффективность метода:
- Эффективен при диагностике мочеполового шистосомоза и редко
встречаемой инвазии почечных лоханок: диоктофимозе.
- Иногда у девочек и женщин в моче можно обнаружить яйца
остриц (смываемые мочой с промежности).
Применение метода
- Чаще применяется как специальный метод диагностики
мочеполового шистосомоза.
5.3.2. Метод фильтрации
Ход исследования:
- 5-10 мл мочи от порции, собранной с 11 ч утра до 15 ч дня,
или все порции суточной мочи смешивают с равным количеством
детергента - типола.
- Фильтруют под вакуумом через фильтровальную бумагу (или
фильтры N 1).
- На увлажненных фильтрах обнаруживают яйца и личинки
гельминтов при микроскопии.
- Микроскопируют при увеличении: объектив х 8 или х 10, окуляр
х 10.
Эффективность метода
- Эффективен при слабой шистосомозной инвазии.
Применение метода
- Для диагностики мочеполового шистосомоза.
6. ЛАРВОСКОПИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ЭПИДЕРМИСА КОЖИ
Необходимые реактивы и оборудование:
1. Физиологический раствор.
2. Стерильные иглы.
3. Стерильное лезвие бритвы или глазной скальпель.
4. Стерильные чашки Петри.
5. Физиологический раствор.
6. Предметные и покровные стекла.
7. Микроскоп.
Подготовка к работе:
- Кончиком иглы приподнимают эпидермис кожи и лезвием бритвы
или острым глазным скальпелем срезают кусочек кожи диаметром 2-3
мм (бескровно, соблюдая правила асептики).
- Делают одновременно несколько срезов, главным образом с тех
участков, на которых заметны изменения кожи и отмечается зуд (чаще
в области гребешков подвздошной кости, боковых поверхностей
грудной клетки).
- Помещают в стерильную чашку Петри с физраствором.
6.1. Метод исследования нативного препарата
Ход исследования:
- Биоптат эпидермиса кожи помещают на предметное стекло в
каплю изотонического раствора хлорида натрия.
- Микроскопируют сразу после приготовления препарата при
увеличении: объектив х 8 или х10, окуляр х10.
Примечание. Из положительных препаратов можно приготовить
постоянные препараты: высушить, зафиксировать метанолом, окрасить
по Романовскому - Гимзе.
6.2. Метод "обогащенного" препарата
Ход исследования:
- Срезы кожи помещают в пробирку с физраствором или средой с
коллагеназой и оставляют при температуре 24-37 град. С на 24-36 ч.
- Надосадочную жидкость сливают.
- Осадок переносят на предметное стекло и микроскопируют при
увеличении: объектив х 8 или х 10, окуляр х 10.
Эффективность метода:
- Эффективен при диагностике онхоцеркоза, кожного
дипеталонематоза (стрептоцеркоза).
- Менее эффективен при кожных поражениях типа линейного
дерматита, вызываемых мигрирующими личинками нематод, шистосом и
др.
Применение метода
- При диагностике онхоцеркоза, кожного дипеталонематоза
(стрептоцеркоза).
7. ЛАРВОСКОПИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ МЫШЕЧНОЙ ТКАНИ
ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ЛИЧИНОК ТРИХИНЕЛЛ
7.1. Метод трихинеллоскопии
Материал на исследование: поперечно - полосатая мышечная
ткань, кроме мышцы сердца.
Необходимое оборудование:
1. Стеклянный компрессорий или предметные стекла (размером
12 х 6 или 15 х 8 см).
2. Стереоскопический микроскоп МБС.
3. Препаровальные иглы.
4. Термостат.
5. Ножницы, скальпель.
6. Измельчитель ткани.
7. Эмалированные кюветы.
8. Химические стаканчики.
9. Чашки Петри.
10. Пипетки.
7.1.1. Компрессорная трихинеллоскопия
Ход исследования:
- Каждую пробу мышц перед исследованием помещают в чашки
Петри, расположенные на эмалированных кюветах, куда помещают и
необходимый инструментарий (ножницы, пинцеты, препаровальные
иглы), предметные стекла. Работа проводится в перчатках с
соблюдением правил техники безопасности.
- Из каждой пробы мышц (от одного больного) ножницами делают
срезы строго вдоль мышечных волокон, величиной с "овсяное зерно".
Всего из разных участков пробы делают 24 среза, а при
отрицательных результатах в 3-4 раза больше.
- Каждый срез помещают на отдельный квадрат нижнего стекла
компрессория (всего в компрессории 24 квадрата) и сдавливают
верхним стеклом, путем завинчивания закрепляющих винтов
компрессория. При отсутствии компрессория срезы помещают на
большое предметное стекло, причем на значительном расстоянии друг
от друга, чтобы во время сдавливания они не сливались. Накрывают
сверху покровным стеклом меньших размеров и сдавливают до толщины
папиросной бумаги.
- Микроскопируют все срезы (каждый срез в отдельности)
применяя стереоскопический микроскоп МБС с увеличением: объектив х
2 или х 4, окуляр х 12; х 14; х 14,5.
- При обнаружении в мышцах хотя бы одной личинки трихинелл все
пробы мышц утилизируют, перед этим засыпаются или заливаются
дезинфектантами: 10%-ным раствором лизола А, сухой хлорной
известью или белильной термостойкой известью, или применяют
водяной насыщенный пар под давлением 1,5 кГс/кв. см (0,15 МПа)
126 +/-2 град. С. Инструментарий и лабораторная посуда
обезвреживается кипячением в течение 60 мин (с момента закипания),
или автоклавируются (при вышеуказанном режиме).
Диагностика личинок трихинелл бывает затруднена, если срезы
толстые или кусочки мышц подсохли, или в срезах обильные включения
жира, или пробы мышц фиксированы формалином, или личинки находятся
в обызвествленных капсулах.
В этих случаях:
- можно поместить срезы мышц в 5%-ный раствор едкой щелочи и
выдержать в течение 1 ч при комнатной температуре или 10 мин в
термостате при температуре 45 град. С;
- срезы с обызвествленными капсулами, где личинки не видны,
помещают предварительно в 5-10%-ный раствор соляной кислоты на 1-2
ч, чтобы растворить известь, затем помещают в глицерин или
молочную кислоту для просветления.
Результат микроскопирования: инкапсулированная личинка
трихинелл в мышцах представляет собой капсулу личинки лимоновидной
или овальной формы; размеры 0,5-0,7 х 0,2-0,3 мм; внутри капсулы
одна, реже две или три спиралевидно свернутые личинки. При
бескапсульном варианте обнаруживаются только спиралевидно
свернутые личинки (см. приложение 5).
7.1.2. Трихинеллоскопия методом переваривания
в искусственном, желудочном, соке
Реактивы:
- Соляная кислота концентрированная (или 1%-ная для 2-го
варианта прописи)
- Медицинский пепсин кристаллический (или 3%-ный для 2-го
варианта прописи)
- Дистиллированная вода
Подготовка к работе
- Мышечную ткань измельчают до состояния фарша.
- Готовят раствор искусственного желудочного сока по одной из
прописей:
1) 1 л дистиллированной воды + 7 мл 1%-ного раствора соляной
кислоты + 5 мл 3%-ного раствора пепсина;
2) 1 л дистиллированной воды + 7 мл концентрированной соляной
кислоты + 5-7 г пепсина кристаллического.
Ход исследования:
- Количество искусственного желудочного сока на мышечную массу
рассчитывается из расчета: на 10 частей искусственного желудочного
сока - 1 часть мышечной массы (например: на 100 мл желудочного
сока - 10 г мышечного фарша).
- В химический стакан с желудочным соком помещают мышечную
массу и тщательно размешивают.
- Помещают в термостат при температуре 37 град. С на 16-18 ч,
периодически помешивая стеклянной палочкой.
- После переваривания всю массу помещают в аппарат Бермана, на
сито из мельничного газа (N 26).
- Через 1,5-2 ч все личинки оседают на дно пробирки, пробирку
снимают, отсасывают верхний надосадочный слой пипеткой.
- Осадок переносят в чашку Петри или предметные стекла и
микроскопируют под стереоскопическим микроскопом МБС, увеличение:
объектив х 2 или х 4, окуляр х 12 или х 14.
При использовании 2-го варианта прописи желудочного сока
реакция ускоряется и ход проведения методики меняется.
- Фарш помещают в пробирку с желудочным соком (в соотношении
1:25 или 1:50) и ставят в термостат при температуре 42-47 град. С
на 3,5 ч.
- Личинки осаждают в химическом стаканчике емкостью 50 мл в
течение 20-30 мин.
- Надосадочную жидкость сливают.
- Осадок микроскопируют в чашке Петри с использованием
стереоскопического микроскопа МБС, увеличение: окуляр х 12, х 14,
х 14,5; объектив х 2, х 4.
- Непереваренные мышечные волокна можно окрасить 0,25%-ным
раствором бриллиантового зеленого, в результате хорошо видны
недекапсулированные личинки трихинелл.
Эффективность метода:
- Метод компрессионной трихинеллоскопии эффективен при высокой
и средней интенсивности трихинеллезной инвазии.
- Для повышения эффективности обнаружения личинок трихинелл
следует увеличить количество исследуемых мышечных срезов в 3-4
раза, т.е. вместо 24 исследовать 72-96 срезов.
- При низкой интенсивности инвазии более эффективен метод
переваривания в искусственном желудочном соке.
Применение метода:
- Применяется как метод прямой диагностики для обнаружения
личинок трихинелл в мышечной ткани.
8. МИКРОСКОПИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ КОСТНОГО МОЗГА,
СОДЕРЖИМОГО КОЖНЫХ ЯЗВ И БУГОРКОВ НА ЛЕЙШМАНИИ
Материал на исследование: костный мозг, язвенный краевой
инфильтрат, содержимое кожных бугорков.
8.1. Метод мазка из кожного инфильтрата
Отбор материала на исследование:
- Бугорок или участок инфильтрата протирают ватным спиртовым
тампоном.
- Стерильным скальпелем делают поверхностный надрез кожи (при
этом сдавливают пальцами бугорок для обескровливания).
- Со дна и краев надреза этим же скальпелем берется соскоб
пораженной ткани (в случае появления крови при разрезе, ее удаляют
стерильным марлевым тампоном).
Ход исследования:
- Соскоб со скальпеля быстро перенести на предметное стекло и
равномерно растереть (готовят несколько мазков).
- Приготовленный мазок высушить на воздухе.
- Фиксировать метанолом или в смеси Никифорова.
- Окрашивать по Романовскому (как мазки крови на малярию).
- Микроскопировать с масляной иммерсией: объектив х 90 или х
100; окуляр х 7 или х10.
Результат
1) Лейшмании обнаруживаются в макрофагах, а также вне клеток в
виде округлых, овальных или удлиненных телец размером 3-5 мкм;
цитоплазма лейшманий светло - голубого или синеватого цвета, ядра
- красно - фиолетовые; кинетопласт - окрашен интенсивнее ядра.
2) В правильно приготовленном препарате хорошо различимы
клетки инфильтрата (макрофаги, эндотелиальные, плазматические,
лимфоидные клетки, фибробласты и небольшая примесь клеток
периферической крови).
- Наличие в препарате эпителиальных клеток, а также
бесструктурных глыбок, окрашивающихся в равномерно сиреневый цвет,
означает, что соскоб был взят слишком поверхностно и должен быть
повторен.
- Лейшмании легко обнаруживаются в бугорках и в краевом
инфильтрате язвы на начальных стадиях изъязвления; в гнойном
отделяемом язвы могут быть обнаружены лишь деформированные и
разрушающиеся лейшмании (по которым трудно поставить диагноз); на
стадии заживления в пораженных тканях лейшмании обнаруживаются
редко; при туберкулоидном лейшманиозе в бугорках обнаруживаются с
трудом.
Применение метода
- Для диагностики кожного лейшманиоза.
8.2. Метод мазка костного мозга
Ход исследования:
- Материал, полученный при пункции костного мозга, немедленно
после взятия переносят на предметное стекло.
- Очень осторожно, чтобы не деформировать клетки, распределить
при помощи шлифовального стекла тонким слоем.
- Если пунктат плотный, то мазок можно сделать по принципу
"отпечатков", держа комочек пунктата пинцетом или иглой, или
прикасаясь к нему предметным стеклом.
- Мазок высушить на воздухе.
- Фиксировать: в абсолютном этиловом спирте или в смеси
Никифорова 30 мин, или в метиловом спирте 5 мин.
- Высушить на воздухе.
- Окрашивать краской по Романовскому (рабочий раствор
готовится непосредственно перед окраской и на буферном растворе
рН=6,9-7,1) 30-50 мин.
- Промыть дистиллированной водой.
- Высушить на воздухе.
- Микроскопировать с масляной иммерсией: объектив х 90 или х
100, окуляр х 7 или х 10.
Результат: лейшмании обнаруживаются в макрофагах или
внеклеточно; они имеют вид округлых, овальных или рисовидных телец
диаметром 3-5 мкм; цитоплазма окрашена в серовато - голубой цвет,
ядро в красно - фиолетовый; в цитоплазме имеется кинетопласт в
виде округлого или палочковидного образования и окрашивается более
интенсивно, чем ядро. Иногда принимают за лейшмании кровяные
пластинки или "осколки" клеток (комочки цитоплазмы, содержащие
ядерное вещество). В редких случаях источником ошибки при
микроскопии могут служить посторонние микроорганизмы (дрожжевые
грибки, одноклеточные водоросли), которые могут попасть со стенок
посуды - в мазке они окрашиваются более интенсивно (темно - синяя
цитоплазма, ярко - малиновое ядро) и кинетопласт отсутствует.
Применение метода
- Для диагностики висцерального (внутреннего) лейшманиоза.
Примечание. При висцеральном лейшманиозе есть вероятность
обнаружения паразитов и в периферической крови; в отдельных
случаях для диагностики висцерального лейшманиоза исследуют
пунктаты селезенки, печени и лимфатических узлов.
9. ОСОБЕННОСТИ ТЕХНИКИ МИКРОСКОПИРОВАНИЯ ПРИ
ИССЛЕДОВАНИИ НА ЯЙЦА, ЛИЧИНКИ ГЕЛЬМИНТОВ
И ЦИСТЫ ПРОСТЕЙШИХ
1. Важным условием успешного микроскопирования является
регулирование света с помощью конденсора и других приспособлений
светорегуляции: например, полностью опущенный конденсор
обеспечивает максимальную контрастность, полностью поднятый
конденсор обеспечивает максимальную яркость изображения. При
исследовании на яйца гельминтов желательна большая контрастность,
при исследованиях на простейшие необходимо обеспечить достаточную
яркость изображения.
2. Поле зрения микроскопа при малом увеличении не должно быть
слишком ярким (конденсор опустить вниз или уменьшить освещение),
т.к. яйца гельминтов с прозрачной оболочкой могут остаться
незамеченными. Это касается и простейших.
3. Во время просмотра препаратов при малом увеличении
конденсор микроскопа опускают вниз, что уменьшает освещенность
поля зрения и повышает четкость исследуемого материала. Переводя
объектив на большое увеличение (х 40), конденсор поднимают, что
усиливает освещенность поля зрения.
4. Яйца и личинки в препарате могут находиться внизу, на
поверхности и в толще капли (мазка), поэтому препарат
просматривают по вертикали на всех уровнях. При этом очень важно
отработать определенный автоматизм: одной рукой фиксировать и
передвигать предметное стекло, а другой постоянно, плавно вращать
винт макро- и микронаводки то в одну, то в другую сторону, чтобы
исследовать всю толщину препарата.
5. Начинают исследовать препарат с правого или левого края
предметного стекла, зигзагообразно, как при исследовании мазка
крови, при этом препарат перемещают на одно поле зрения.
Микропрепарат просматривают полностью, даже если были находки уже
в первых полях зрения, т.к. может быть смешанная инвазия.
6. При гельминтоовоскопии лучше использовать объектив х 8, х
10 и х 40, окуляр х 7 и х 10 (поиск яиц ведется при малом
увеличении, морфологическое строение и идентификация проводятся
при большом увеличении); при протозооскопии работают с объективом
х 40 и окуляром х 10.
7. При работе с микроскопом "БИОЛАМ" лучше пользоваться
дневным естественным освещением или светом от ламп дневного
освещения (настенных, настольных). В микроскопах "БИМАМ" (или
импортных марок типа "Leica", "Zeiss") используется свет от
вмонтированного электрического осветителя, при этом матовое стекло
должно быть вставлено перед конденсором микроскопа.
8. Лаборанту начинать микроскопировать необходимо на
микроскопе одной и той же марки, где он изучает не только
морфологическое строение яиц гельминтов, но и учится визуально без
измерительных приборов соизмерять величину обнаруженных объектов
(яиц гельминтов, цист простейших и т.д.). При использовании одних
и тех же увеличений микроскопы разных марок (разных фирм -
производителей) дают разные размеры объектов, что может привести к
диагностическим ошибкам.
9. Для исследования на личинки гельминтов можно использовать
микроскоп стереоскопический системы МБС (увеличения: объектив х
12, х 14, окуляр х 2).
10. При идентификации яиц и личинок гельминтов, а также
протозойных объектов можно использовать микрометрический метод
диагностики. Измерения яиц гельминтов под микроскопом можно
проводить с помощью окуляр - микрометра, но предварительно для
каждого микроскопа и для тех увеличений, с которыми работает
исследователь, нужно определить значение одного деления окулярной
линейки в микронах.
10. МИКРОМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД ПРОТОЗОО- И ГЕЛЬМИНТОСКОПИИ
Необходимое оборудование:
1. Микроскоп с необходимым набором окуляров и объективов.
2. Окуляр - микрометр со шкалой, разделенной на миллиметровые
интервалы с дополнительными делениями - штрихами.
3. Объект - микрометр (линейка на стекле длиной 1 мм, значение
величины одного деления 0,01 мм или 10 мкм).
Подготовка к работе
Определить до начала наблюдения значение цены одного деления
шкалы окуляр - микрометра для каждой применяемой комбинации
объектив - окуляр<*>.
- Поместить объект - микрометр на предметный столик микроскопа
и сфокусировать окуляр на линейке объект - микрометра так, чтобы
шкала делений стала резкой.
- Заменить простой окуляр на окуляр - микрометр, с которым
предстоит выполнять измерения объекта, и удостовериться, что
деление линеек окуляра и объект - микрометра расположены в одной
плоскости.
- При малом увеличении объектива совместить шкалы линеек
окуляр - микрометра и объект - микрометра параллельно друг под
другом.
- Выделить (найти) такое положение линеек, где определенное
число делений окуляр - микрометра полностью совпадает с целым
числом делений объект - микрометра.
- Определить цену одного деления окуляр - микрометра: число
интервалов на линейке объект - микрометра (У), строго
соответствующих целому числу делений окуляр - микрометра, умножить
на 10 мкм и затем разделить на число совпадающих делений шкалы
окуляр - микрометра (X), т.е. цена одного деления шкалы окуляр -
микрометра в данной оптической системе определяется по формуле (10
х У : Х).
- Аналогичным образом определить цену деления шкалы
окуляр - микрометра для всех объективов микроскопа, с которыми
предполагается проводить микрометрические исследования.
- При особо ответственных исследованиях проверять цену деления
окуляр - микрометра при смене объективов даже в пределах одного
типа.
Ход измерения объекта:
- Выбрать соответствующий окуляр и объектив для работы<**>.
- Сфокусировать систему объектив - окуляр на объекте, который
должен быть измерен.
- Заменить простой окуляр на окуляр - микрометр.
- Определить число делений (интервалов) шкалы
окуляр - микрометра, покрывающих длину и (или) ширину измеряемого
объекта.
Определить действительный размер объекта путем умножения
полученного числа на значение цены деления шкалы окуляр -
микрометра при данной системе объектива и окуляра.
--------------------------------
<*> Следует помнить, что величина деления окуляр - микрометра
меняется в зависимости от длины тубуса и увеличения окуляра и
объектива используемого микроскопа.
<**> Измерение протозойных объектов, также как и яиц
гельминтов, для получения более точных данных следует проводить
при увеличении в 300-400 раз.
Примечание. Во избежание необходимости при каждом измерении
умножать полученное число на значение цены одного деления окуляр -
микрометра можно заранее составить таблицу, в которой вычислены
значения 1, 2, 3 и т.д. делений окуляр - микрометра.
Эффективность метода
- Метод позволяет осуществлять проведение прямых измерений
величины объекта, не требует сложных расчетов, дорогой аппаратуры,
доступен для лабораторий разного уровня.
Применение метода
- Для уточнения видовой принадлежности паразитарных объектов
на основе размера - одного из основных морфофункциональных
критериев видовой характеристики паразита.
- Дифференциальная диагностика псевдопаразитарных образований.
Приложение N 1
ИНФОРМАТИВНОСТЬ ПАРАЗИТОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЙ
-------------T-------------------T---------------------------------¬
¦Материал для¦Метод исследования ¦ Применяется для диагностики ¦
¦исследования¦ ¦ заболеваний ¦
+------------+-------------------+---------------------------------+
¦Фекалии ¦толстый мазок по ¦описторхоз, клонорхоз, фасциолез,¦
¦ ¦Като и Миура ¦дикроцелиоз, метаго - нимоз, ¦
¦ ¦ ¦нанофиетоз, дифиллоботриоз, ¦
¦ ¦ ¦гименолепидоз, аскаридоз, ¦
¦ ¦ ¦трихоцефалез, анкилостомидозы, ¦
¦ ¦ ¦дипилидиоз ¦
¦ +-------------------+---------------------------------+
¦ ¦седиментации ¦описторхоз, клонорхоз, фасциолез,¦
¦ ¦ ¦дикроцелиоз, метаго - нимоз, ¦
¦ ¦ ¦нанофиетоз, дифиллоботриоз, ¦
¦ ¦ ¦гименолепидоз, аскаридоз, ¦
¦ ¦ ¦трихоцефалез, анкилостомидозы, ¦
¦ ¦ ¦стронгилоидоз, трихостронгилез, ¦
¦ ¦ ¦некатороз, шистосомоз, кишечные ¦
¦ ¦ ¦протозоозы (лямблиоз, ¦
¦ ¦ ¦криптоспоридиоз, изоспороз) ¦
¦ +-------------------+---------------------------------+
¦ ¦флотации ¦аскаридоз, трихоцефалез, ¦
¦ ¦ ¦анкилостомидозы, трихостронгилез,¦
¦ ¦ ¦некатороз, гименолепидоз, ¦
¦ ¦ ¦дифиллоботриоз, тениидозы ¦
¦ +-------------------+---------------------------------+
¦ ¦Бермана и его ¦стронгилоидоз, трихостронгилез, ¦
¦ ¦модификации ¦анкилостомидоз, некатороз, ¦
¦ ¦ ¦балантидиаз ¦
¦ +-------------------+---------------------------------+
¦ ¦нативный мазок с ¦лямблиоз, балантидиа, амебиаз, ¦
¦ ¦физраствором и ¦инфекции вызванные диентамебой, ¦
¦ ¦раствором Люголя ¦бластоцистоз ¦
¦ +-------------------+---------------------------------+
¦ ¦окрашенный мазок по¦криптоспоридиоз ¦
|
