|
Стр. 1
УТВЕРЖДАЮ
Первый заместитель Председателя
Госкомсанэпиднадзора России,
заместитель Главного государственного
санитарного врача Российской Федерации
С.В.СЕМЕНОВ
29 октября 1996 года
Дата введения - с момента
утверждения
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ
И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
МЕТОДЫ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО КОНТРОЛЯ ПРОДУКТОВ
ДЕТСКОГО, ЛЕЧЕБНОГО ПИТАНИЯ И ИХ КОМПОНЕНТОВ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
МУК 4.2.577-96
1. Разработаны: Институтом питания Российской академии
медицинских наук (В.А. Тутельян, И.Б. Куваева, И.Я. Конь, С.А.
Шевелева, Н.Р. Карликанова); Научно - исследовательским институтом
детского питания Российской академии сельскохозяйственных наук
(Н.Н. Липатов, Г.П. Шаманова, Н.А. Пронягина); Минсельхозпродом
России (Г.Ю. Сажинов, И.Г. Вертинская, Р.Е. Овакимян).
2. Утверждены и введены в действие первым заместителем
председателя Госкомсанэпиднадзора России, заместителем главного
государственного санитарного врача Российской Федерации 29 октября
1996 года.
3. Введены взамен СанПиН "Микробиологические нормативы и методы
анализа продуктов детского, лечебного и диетического питания и их
компонентов", утвержденных бывшим Минздравом СССР от 21.12.88 N 42-
123-4940-88, в части методов микробиологического контроля.
1. Общие положения
1.1. Настоящие Методические указания устанавливают методы
лабораторных исследований (испытаний) качества продуктов детского,
лечебного питания и их компонентов (в том числе импортируемых в
Российскую Федерацию) по микробиологическим показателям
безопасности для здоровья человека, проводимых в порядке
производственного контроля, государственного и ведомственного
санитарно - эпидемиологического надзора, а также при испытаниях
указанной продукции в целях сертификации соответствия.
1.2. Методические указания разработаны в соответствии с Законом
РСФСР "О санитарно - эпидемиологическом благополучии населения",
Положением о Государственном санитарно - эпидемиологическом
нормировании, Положением о Государственной санитарно -
эпидемиологической службе Российской Федерация.
1.3. Методические указания предназначены для применения в
лабораториях предприятий, организаций и учреждений (далее -
организации), осуществляющих производственный контроль качества
при разработке новых видов продуктов детского, лечебного питания и
их компонентов, постановке их на производство и в процессе
промышленного выпуска, в лабораториях организаций Государственной
санитарно - эпидемиологической службы Российской Федераций и
ведомственных санитарно - эпидемиологических служб федеральных
органов исполнительной власти, а также в лабораториях иных
организаций, аккредитованных на право проведения испытаний
указанной продукции для целей ее сертификации.
1.4. В соответствии с настоящими Методическими указаниями
должен осуществляться микробиологический контроль за безопасностью
пищевых компонентов и продуктов детского, лечебного и диетического
питания, импортируемых в Российскую Федерацию.
1.5. Настоящие Методические указания должны учитываться при
пересмотре действующей и разработке вновь создаваемой нормативной
документации на продукты детского и лечебного питания и
компоненты, используемые при их изготовлении.
2. Нормативные ссылки
2.1. Закон РСФСР "О санитарно - эпидемиологическом благополучии
населения" от 19 апреля 1991 года.
2.2. Положение о Государственном санитарно - эпидемиологическом
нормировании, утвержденное Постановлением Правительства Российской
Федерации от 5 июня 1994 г. N 625.
2.3. Положение о Государственной санитарно - эпидемиологической
службе Российской Федерации, утвержденное Постановлением
Правительства Российской Федерации от 5 июня 1994 г. N 625.
2.4. ГОСТ 26668-85 "Продукты пищевые и вкусовые. Порядок отбора
проб для микробиологических анализов".
2.5. ГОСТ 26809-86 "Молоко и молочные продукты. Отбор проб и
подготовка к испытаниям".
2.6. ГОСТ 9225-84 "Молоко и молочные продукты. Методы
микробиологического анализа".
2.7. ГОСТ 13928-84 "Молоко и сливки заготовляемые. Правила
приемки, методы отбора и подготовки проб к анализу".
3. Методы отбора проб сырья, компонентов
и готовой продукции
3.1. Отбор проб - по ГОСТу 26809 "Молоко и молочные продукты.
Отбор проб и подготовка к испытанию", ГОСТу 13928 "Молоко и сливки
заготовляемые. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к
анализу", ГОСТу 9225 "Молоко и молочные продукты. Методы
микробиологического анализа", ГОСТу 26668 "Продукты пищевые и
вкусовые. Порядок отбора проб для микробиологических анализов".
3.2. Посуду с пробой или пробу в потребительской таре снабжают
этикеткой, на которой указывают:
номер пробы;
наименование продукта;
номер и объем партии;
дату и час отбора пробы;
должность и подпись лица, отбиравшего пробу;
обозначение действующей нормативной документации, по которой
вырабатывался продукт.
3.3. Пробу, отправляемую в лабораторию вне данного предприятия,
пломбируют или опечатывают и снабжают этикеткой, на которой
указывают:
номер пробы;
наименование предприятия - изготовителя;
наименование продукта;
номер и объем партии;
дату и час выработки продукта с момента окончания
технологического процесса;
дату и час отбора пробы;
должность и подпись лица, отбиравшего пробу;
объем необходимых анализов;
обозначение действующей нормативной документации, по которой
вырабатывался продукт.
3.4. Микробиологические анализы продукта проводят не более чем
через 4 часа с момента отбора проб.
3.5. Пробы должны храниться и транспортироваться до начала
исследований при температуре продуктов не выше 6 град. С, не
допуская подмораживания.
3.6. Отбор проб для микробиологических исследований
производится специалистом Центра госсанэпиднадзора в присутствии
должностного лица данного предприятия.
4. Аппаратура, материалы, лабораторная посуда и реактивы
4.1. Аппаратура и инструментарий
Анализатор потенциометрический, диапазон
измерении pH от -1 до 14, погрешность
измерений pH +/- 0,05 ГОСТ 19881-74
Аппарат универсальный типа АВУ-6С для
встряхивания жидкости в колбах и
пробирках (шуттель - аппарат) ТУ 64-1-2451-78
Ареометр - сахаромер с диапазоном измерений
0 - 10%, с ценой деления шкалы 0,1% и
пределом допускаемой погрешности +/- 0,1% ГОСТ 18481-87
Баня водяная с подогревом ГОСТ 12026-76
Весы лабораторные общего назначения, 2 и
4 класса точности с наибольшим пределом
взвешивания 200 г (или получаемые по
импорту) ГОСТ 24104-80
Иономер универсальный ЭВ-74 или
потенциометр pH-340 ГОСТ 9245-79
Лотки эмалированные или кристаллизаторы
Лупа измерительная ГОСТ 25706-93
Микрокалькулятор типа "Электроника БЭ-0914М",
"БЭ-14", "БЭ-21" или др. типов ГОСТ 27201-87
Микроскоп биологический МБИ-1, МБИ-2,
МБИ-3, МБР-1, МБР-3 (или полученный по
импорту с иммерсионной системой) ГОСТ 8284-78
Нож консервный
Ножницы медицинские ГОСТ 21239-89
Облучатель бактерицидный настенный ОБН-150
или других видов ТУ 16-535-84
Осветители к микроскопу типа ОИ-7, ОИ-9,
ОИ-18, ОИ-19 или других марок
Пинцет медицинский ГОСТ 21241-89
Прибор для счета колоний бактерий ПСБ ТУ 64-1-2041-72
Скальпель хирургический, 15 см ГОСТ 21240-89
Стерилизаторы паровые медицинские или
аналогичные ГОСТ 19569-89
Стерилизаторы медицинские паровые и
воздушные ГОСТ 27437-87
Термостат, позволяющий поддерживать
температуру (15 - 65) град. С с отклонением
от заданной +1 град. С (или получаемый ТУ 64-1-1382-72
по импорту)
Холодильник бытовой электрический (или
получаемый по импорту) ГОСТ 16317-87
Центрифуга медицинская с числом оборотов
не менее 3000 об./мин.
Часы механические сигнальные ГОСТ 3145-84
Часы песочные настольные на 1,5 и 10 мин.
Шкаф сушильный стерилизационный ШСС -
80П или др. видов, позволяющий поддерживать
температуру (160 + 5) град. С ТУ 64-1-9009-74
Шпатели металлические или фарфоровые
15 - 20 см
Штативы металлические, пластмассовые или
деревянные
Электроплитка ГОСТ 14919-83
4.2. Лабораторная посуда и материалы
Бумага индикаторная универсальная ТУ 6-091181-76
Бумага фильтровальная лабораторная ГОСТ 12026-76
Бутылки стеклянные для химических реактивов
Вата медицинская гигроскопическая ГОСТ 5556-81
Воронки стеклянные ГОСТ 25336-82
Бюретки исполнения 1, 2, 3 классов
точности, вместимостью 5, 10, 50 куб. см,
с ценой деления 0,1 куб. см ГОСТ 29251-91
Дозатор пипеточный одноканальный ДП-1-1000
производства ВНИИ биопрепаратов (г. Москва)
Карандаш по стеклу
Кастрюли разные ГОСТ 17151-81
Кастрюли эмалированные ГОСТ 24778-81
Марля медицинская ГОСТ 9412-77
Колбы типа Кн, номинальной вместимостью
40, 200, 400, 1000, 1600 куб. см ГОСТ 19908-90
Колбы исполнения 2, 2 класса точности,
номинальной вместимостью 250 куб. см ГОСТ 25336-82
Колбы исполнения 2, 2 класса точности,
номинальной вместимостью 50, 100, 200, 500,
1000 куб. см ГОСТ 1770-74
Колбы мерные исполнения 1, 2 класса
точности, номинальной вместимостью 50, 100
и 1000 куб. см ГОСТ 1770-74
Палочки стеклянные
Пергамент ГОСТ 1341-84
Подпергамент ГОСТ 1760-86
Петли бактериологические
Пипетки исполнения 5, 1, 2 классов
точности, вместимостью 1 куб. см ГОСТ 29227-91
Пипетки исполнения 7, 1, 2 классов
точности, вместимостью 10 куб. см ГОСТ 29227-91
Пробирки Уленгута (поплавки)
Пробирки типов П1, П2, диаметром 16 мм,
высотой 150 мм и диаметром 21 мм, высотой
200 мм ГОСТ 25336-82
Пробки корковые ГОСТ 5541-76
Проволока нихромовая, диаметром 0,4 - 0,5 мм
для изготовления бактериологических петель
и игл
Проволока платиновая для изготовления
бактериологических петель
Спиртовки лабораторные стеклянные ГОСТ 23932-90
Стаканчики для взвешивания типа СВ ГОСТ 25336-82
Стаканы типа ВН, вместимостью 100 и
200 куб. см ГОСТ 19908-90
Стекла предметные для микропрепаратов ГОСТ 6672-75
Стекла покровные для микропрепаратов ГОСТ 6672-75
Ступка фарфоровая с пестиком ГОСТ 9147-80
Термометр (ртутный) с диапазоном измерения
от 0 до 100 град. С, с ценой деления
шкалы 1 град. С ГОСТ 13646-68
Термометр жидкостный (нертутный) с
диапазоном измерения от 0 до 100 град. С,
с ценой деления шкалы 1 град. С ГОСТ 28498-90
Ткань мягкая льняная (кусочки)
Трубки медицинские резиновые, диаметром
7 - 10 мм ГОСТ 3399-76
Цилиндры исполнения 1, вместимостью 100,
500 куб. см ГОСТ 1770-74
Чашки биологические (Петри) ГОСТ 23932-90
Шпагат ГОСТ 16266-70
4.3. Реактивы, питательные среды
Агар микробиологический ГОСТ 17206-84
Агар питательный сухой ТУ 42-14-33-75
или ТУ 10-02-789-177-94
Агар сывороточный БФ ТУ 491059-84
или ТУ 10-02-02-789-177-94
Агар типа Байрд - Паркера ТУ 10-02-02-789-176-94
Агар солевой ТУ 10-02-02-789-176-94
Бульон солевой ТУ 10-02-02-789-176-94
alfa-нафтол технический
Бензин авиационный ГОСТ 1012-72
Бриллиантовый зеленый ТУ 6-09-4279-76
Бромтимоловый синий ТУ 6-09-20-86-77
Вода дистиллированная ГОСТ 6709-72
Вода питьевая ГОСТ 2874-82
Висмут сульфитный агар ТУ 42 141-27-78
Гидролизат казеина панкреатический ТУ 42-14-1-74
Дефибринированная кровь человека,
барана или кролика
Дрожжи хлебопекарные прессованные ГОСТ 171-81
D-глюкоза, ч. ГОСТ 6038-79
D-лактоза, 1-водная ТУ 6-09-22-98-79
D(+) мальтоза для микробиологических
целей
DL-триптофан ТУ 6-09-1492-80
Желчь сухая или желчь нативная
сельскохозяйственных животных,
стерильная ОСТ 49 278-75
Железо III серно - кислое, 9-водное ГОСТ 9485-74
Йод ГОСТ 4159-79
Калия гидроокись ГОСТ 24363-80
Калий йодистый, ч.д.а. ГОСТ 4232-74
Калий фосфорно - кислый
однозамещенный, ч. ГОСТ 4198-75
Калий фосфорно - кислый
двузамещенный 3-водный ГОСТ 2493-75
Кальций углекислый ГОСТ 4530-76
Кислота соляная, х.ч. ГОСТ 3118-77
Кислота молочная пищевая ГОСТ 490-79
Кристаллический фиолетовый ТУ 6-09-4119-75
Левомицетин (медпрепарат)
Лимонная кислота, х.ч. или ч. ГОСТ 3652-69
Литий хлористый, ч. или х.ч.,
или ч.д.а. ГОСТ 4328-77
L-цистин соляно - кислый или цистин
соляно - кислый, получаемый по импорту ТУ 6-093252-80
Магний серно - кислый, 7-водный ГОСТ 4523-77
Магний хлористый 6-водный, ч.х.ч.
или х.ч., или ч.д.а. ГОСТ 4209-77
Масло иммерсионное для микроскопии ГОСТ 13739-78
Медь серно - кислая, 5-водная, х.ч. ГОСТ 4165-78
Метиленовый голубой, индикатор,
получаемый по импорту
Молоко коровье, обезжиренное,
стерильное, приготовленное
(в пробирках) ГОСТ 9225-84
Молоко коровье, обезжиренное, сухое ГОСТ 10970-87
Мочевина (карбамид) ГОСТ 6691-77
Мясо - пептонный бульон
Набор для окраски по Граму
Натрий - аммоний фосфорно - кислый
двузамещенный, 4-водный, ч.
или х.ч. ГОСТ 4170-78
Натрия гидроокись, ч.д.а. ГОСТ 4328-77
Натрий лимонно - кислый, 5,5-водный,
ч.д.а. ГОСТ 22280-75
Натрий серноватисто - кислый (натрия
трисульфат), 5-водный ГОСТ 27068-86
Натрий хлористый, ч. или х.ч.,
или ч.д.а. ГОСТ 4233-77
Неомицин (медпрепарат)
Панкреатин медицинский, активностью
50 ЕД в 1 г ФХ 362
Пара-диметиламидобензальдегид, ч. ТУ 6-09-3272-77
Пенициллин (медпрепарат)
Пергидроль 30% (водорода перекись) ГОСТ 177-88
Пептон сухой ферментативный для
бактериологических целей ГОСТ 13805-76
Полимиксин "М" сульфат по 500000 ЕД
(медпрепарат)
Плазма крови кролика сухая
Сахароза ГОСТ 5833-75
Спирт этиловый ректификованный
технический ГОСТ 18300-87
Спирт этиловый ректификованный ГОСТ 5962-67
Соль Мора ГОСТ 4208-72
Среда с индикатором ВР и маннитом сухая
Среда агаровая модифицированная для
определения общего количества бактерий
в молоке и молочных продуктах ТУ 49513-83
Среда для определения количества
мезофильных аэробных и факультативно -
анаэробных микроорганизмов (общего
количества бактерий)
КМАФАнМ ТУ 10-02-02-789-177-94
Среда Сабуро ТУ 9229-014-004 19789-95
Среда Левина сухая ФС-42-53 ВС-88
Среда Плоскирева ФС-42-193 ВС-88
Среда Ресселя ФС-42-190 ВС-88
Среда Эндо ФС-42-186 ВС-88
Среда Клиглера ТУ 49 876-82
Среда Кесслер сухая ТУ 10.02.875-90
Среда Козера
Среда гидролизатно - молочная
(ГМС-1) для количественного учета
бифидобактерий ТУ 10-02-02-789-176-94
Среда кукурузно - лактозная (ГМК-1)
для количественного учета
бифидобактерий ТУ 10-02-02-789-176-94
Стрептомицин (медпрепарат)
Сусло солодовое неохмеленное
Сыворотка диагностическая
сальмонеллезная 0-агглютинирующая
адсорбированная ТУ 6-09-3838-78
2,3,5-трифенилтетразолий
хлористый, ч.д.а.
Феноловый красный ГОСТ 5853-51
Фенолфталеин ГОСТ 5850-72
Фуксин основной ТУ 6-09-4119-75
Хлороформ технический ГОСТ 20015-76
Экстракт кормовых дрожжей ТУ 42-14-56-76
Экстракт солодовый ГОСТ 418-84
Яйцо куриное диетическое
5. Подготовка к анализу
5.1. Подготовка проб к анализу
5.1.1. Молоко, сливки и другие жидкие
продукты и компоненты
Отобранные пробы перед исследованием тщательно перемешивают.
5.1.2. Сгущенные продукты и компоненты
Отобранную пробу тщательно перемешивают стерильной ложкой,
затем взвешивают стерильную сухую колбу и в нее помещают 10 г
продукта.
5.1.3. Кисло - молочные продукты и напитки, закваски
Отобранные пробы перед исследованием перемешивают и
нейтрализуют. Для этого на каждые 10 куб. см/г исследуемого
продукта или его первого разведения для сухих кисло - молочных
продуктов, напитка или закваски в стерильную посуду добавляют 1,0
куб. см стерильного раствора двууглекислого натрия с массовой
концентрацией 100 г/куб. дм, содержимое перемешивают.
5.1.4. Стерилизованные продукты детского питания
Отобранные пробы перед исследованием тщательно перемешивают.
Перед вскрытием бутылок (пакетов) с продуктом крышку (поверхность
пакета) протирают ватой, смоченной спиртом.
Открывают крышку фламбированным или стерильным консервным
ножом. Края пакета вскрывают стерильным ножом, скальпелем или
ножницами. После снятия крышки края бутылки вновь фламбируют.
5.1.5. Сыр, творог, творожные изделия
и пастообразные продукты
Навеску сыра, творога, творожных изделий и пастообразных
продуктов взвешивают на стерильном часовом стекле, чашке Петри, в
бюксе, переносят в стерильную или фламбированную ступку, прикрытую
крышкой от чашки Петри, и тщательно растирают, нейтрализуют по п.
5.1.3.
5.1.6. Топленое масло или молочный жир
Перед исследованием пробу расплавляют на водяной бане при
температуре от 40 до 45 град. С и перемешивают до получения
однородной эмульсии.
5.1.7. Сухие продукты детского питания и компоненты
Отобранную среднюю пробу тщательно перемешивают, взвешивают
навеску продукта на кусочке стерильного пергамента, на чашке
Петри, в бюксе или на часовом стекле, затем взвешенную пробу
переносят в стерильную колбу или другую посуду.
5.2. Приготовление разведений продуктов для посева
5.2.1. Перед посевом готовят десятикратные разведения продукта
в стерильных растворах разбавленного фосфатного буфера,
изотонического раствора натрия хлорида, пептонной воды или лимонно
- кислого натрия (для сыра).
Для приготовления разведения готовят все необходимые стерильные
материалы и посуду в соответствии со спецификой анализа
исследуемого продукта: пробирки с 9,0 куб. см или колбы с 90,0
куб. см одного из растворов, используемых дня приготовления
разведений.
5.2.2. Из проб молока, сливок, кисло - молочных продуктов и
напитков, кукурузного масла, молочного жира и других жидких
продуктов и компонентов отбирают стерильной пипеткой 10,0 куб. см
и вносят в 90,0 куб. см одного из стерильных растворов,
используемых для приготовления разведений, взбалтывают в течение
(4 +/- 1) мин. круговыми движениями до возможно более полного
растворения. При этом пипетку промывают до 10 раз раствором этого
продукта до верхнего уровня имеющихся на ней делений.
Получают разведение 1:10 (первое разведение).
Топленое масло или молочный жир вносят в растворы, подогретые
до температуры от 40 до 45 град. С.
5.2.3. Приготовленные навески по 10 г сухих молочных продуктов
детского питания, сывороточных белковых концентратов, казецитов и
других компонентов, сгущенных продуктов, сыра, творога, творожных
изделий и других пастообразных продуктов переносят в колбу с 90,0
куб. см одного из стерильных растворов, используемых для
приготовления разведений, подогретых от 40 до 45 град. С и
взбалтывают в течение (4 +/- 1) мин. круговыми движениями до
возможно более полного эмульгирования.
Получают разведение 1:10.
При другом способе разведения к приготовленным навескам по 10 г
вышеуказанных продуктов добавляют 90,0 куб. см одного из
стерильных растворов, подогретых от 40 до 45 град. С и далее
поступают как указано в п. 5.2.3.
5.2.4. Для получения однородной взвеси продукта допускается
перемешивание на аппарате для встряхивания жидкостей в течение (6
+/- 1) мин., избегая намокания пробок. Первое разведение продукта
(1:10) можно гомогенизировать в стерильном стакане гомогенизатора
или растереть в стерильной ступке.
5.2.5. Из первого разведения продукта стерильной пипеткой берут
1,0 куб. см и переносят в пробирку, содержавшую 9,0 куб. см
стерильного раствора, используемого для приготовления разведений,
перемешивают осторожно, набирая и выдувая из пипетки 5 - 10 раз.
Получают второе разведение продукта (1:100). Последующие
разведения в зависимости от предполагаемого обсеменения продукта
1:1000, 1:10000 и т. д. готовят аналогично.
Для приготовления каждого разведения берут новую стерильную
пипетку. Вводят пипетку в пробирку не более чем на 2 - 3 см ниже
поверхности взвеси.
Время от момента приготовления разведений до посева не должно
превышать 20 - 30 мин. Перед посевом все разведения осторожно
встряхивают. При посеве на чашки Петри или в пробирки посевной
материал вносят от большего разведения к меньшему. В этом случае
пользуются одной пипеткой.
5.2.6. Для приготовления разведении сухих молочных каш для
детского питания используют надосадочную жидкость первого
разведения продукта после отстаивания его в течение 2 - 3 мин.
5.3. Подготовка посуды и материалов
5.3.1. Всю новую посуду, предназначенную для бактериологических
работ, кипятят в подкисленной воде (раствор соляной кислоты с
объемной долей 1 - 2%) в течение (15 +/- 5) мин. и затем
ополаскивают дистиллированной водой.
Посуду, бывшую в употреблении, моют 0,5% щелочным раствором с
помощью ершей и щеток и ополаскивают водопроводной водой. Сильно
загрязненную посуду со следами жира, красок и иммерсионного масла
опускают на 2 ч. в хромовую смесь, подогретую от 40 до 45 град. С,
затем тщательно промывают проточной водопроводной водой.
Посуда с питательными средами, после подсчета на них дрожжей,
плесневых грибов, бактерий группы кишечных палочек, E.coli,
S.aureus, энтерококков, сальмонелл и других видов условно -
патогенных и патогенных микроорганизмов, обеззараживается перед
мойкой путем стерилизации в автоклаве при (121 +/- 1) град. С в
течение (30 +/- 1) мин. или кипячением в течение 1 ч.
Вымытую посуду не вытирают, а сушат при комнатной температуре
или горячим воздухом.
Предметные стекла после мойки и ополаскивания вытирают чистой
салфеткой или помещают в склянку с притертой пробкой в смесь
этилового спирта и наркозного эфира в соотношении 1:1.
5.3.2. Лабораторную посуду перед использованием обязательно
стерилизуют. Стерилизацию осуществляют сухим жаром в сушильном
шкафу при (160 +/- 5) град. С в течение 2 ч или паром в автоклаве
при 1 атм. (121 +/- 1) град. С в течение (30 +/- 1) мин. с
последующим подсушиванием в сушильном шкафу.
Перевод давления, показываемого манометром автоклава, в
температуру проводится следующим образом:
0,5 атм. - 112 град. С;
0,7 атм. - 116 град. С;
0,8 атм. - 118 град. С;
1,0 атм. - 121 град. С;
2,0 атм. - 134 град. С.
Чашки Петри, пипетки и т. п. стерилизуют завернутыми в плотную
оберточную бумагу или в пеналах. В верхнюю часть пипетки
предварительно вкладывают кусочек ваты.
Пробирки, флаконы, бутылки, колбы закрывают ватно - марлевыми
пробками. Поверх пробки (кроме пробирок) надевают бумажный
колпачок, который обвязывают вокруг горлышка ниткой или закрепляют
резиновым колечком.
Каучуковые, корковые и стеклянные пробки стерилизуют отдельно в
автоклаве завернутыми в бумагу.
Стерильную посуду хранят в плотно закрывающихся шкафах или
ящиках с крышками. Срок хранения стерильной посуды - не более 30
суток при ненарушенной завертке или невскрытых пеналах.
6. Приготовление питательных сред и реактивов
6.1. Питательные среды и реактивы общего назначения
6.1.1. Концентрированный фосфатный буферный раствор
Взвешивают 34 г однозамещенного фосфорно - кислого калия и
растворяют в 500,0 куб. см дистиллированной воды в мерной колбе,
вместимостью 1000 куб. см. Устанавливают активную кислотность
раствора (7,2 +/- 0,1) ед. pH 1H раствором гидроокиси натрия и
доводят дистиллированной водой до 1000,0 куб. см. Хранят в
емкости, укупоренной резиновой пробкой, в условиях холодильника не
более 30 суток.
6.1.2. Разбавленный фосфатный буферный раствор
Вносят пипеткой, вместимостью 2 куб. см, 1,25 куб. см
концентрированного фосфатного буферного раствора в мерную колбу,
вместимостью 1000 куб. см, и доводят объем дистиллированной водой
до метки, проверяют активную кислотность (7,1 +/- 0,1) ед. pH.
Разливают разбавленный фосфатный буферный раствор по 10,0 куб.
см в пробирки, по 100,0 куб. см в колбы, вместимостью 200 куб. см,
и по 900,0 куб. см в колбы, вместимостью 1600 куб. см, закрывают
ватными пробками. Стерилизуют в автоклаве при (121 +/- 1) град. С
в течение (20+/- 1) мин.
6.1.3. 0,1-процентный водный раствор пептона
(пептонная вода)
К 1,0 куб. дм дистиллированной воды добавляют 1 г пептона.
После размешивания среду кипятят, фильтруют и разливают в пробирки
и флаконы в необходимых количествах. Стерилизует при (121 +/- 1)
град. С в течение (30 +/- 1) мин.
6.1.4. Изотонический 0,85-процентный раствор
хлористого натрия
Для приготовления изотонического раствора, активной
кислотностью (7,0 +/- 0,1) ед. pH, используют дистиллированную
воду, pH которой проверяют индикатором бромтимолблау. При его
добавлении цвет воды должен быть бутылочно - зеленым. В иных
случаях воду не используют.
В 1,0 куб. дм воды растворяют 8,5 г хлористого натрия,
разливают раствор в чистые пробирки, диаметром 18 - 20 мм, по 10,0
куб. см, а в колбы - по 93,0 куб. см и стерилизуют в течение (15
+/- 1) мин. при (121 +/- 1) град. С.
6.1.5. Приготовление раствора лимонно - кислого натрия
для приготовления разведений сыра
В 1000,0 куб. см дистиллированной воды растворяют 20 г
трехзамещенного лимонно - кислого натрия, разливают в пробирки по
10,0 куб. см и колбы по 93,0 куб. см и стерилизуют при (121 +/- 1)
град. С в течение (20 +/- 1) мин.
6.1.6. Стерильная дистиллированная вода
Дистиллированную воду разливают в колбы или пробирки в
необходимых количествах и стерилизуют в течение (20 +/- 1) мин.
при (121 +/- 1) град. С.
6.1.7. Раствор двууглекислого натрия для нейтрализации
проб кисло - молочных продуктов и закваски
10 г двууглекислого натрия помещают в мерную колбу,
вместимостью 100 куб. см, растворяют дистиллированной водой,
доводят объем раствора до метки. Раствор разливают в пробирки и
стерилизуют при (121 +/- 1) град. С в течение (30 +/- 1) мин.
6.1.8. Реактивы для окраски по Граму
(модификация Г.П.Калины)
Реактив 1.
К 100,0 куб. см этилового спирта добавляют 0,5 г
кристаллического фиолетового.
Реактив 2.
К 96,0 куб. см 0,5-процентного спиртового раствора йодистого
калия добавляют 2,0 куб. см 5-процентного спиртового раствора
основного фуксина и 2,0 куб. см 5-процентного спиртового раствора
йода.
Примечание. Растворение йодистого калия в спирте рекомендуется
проводить в водяной бане при температуре от 45 до 50 град. С при
постоянном помешивании.
6.1.9. Приготовление реактивов из метиленового голубого
Приготовление основного спиртового раствора метиленового
голубого.
10 г метиленового голубого смешивают со 100,0 куб. см 96-
процентного этилового спирта. Раствор ставят в термостат при
температуре (37 +/- 1) град. С на (24 +/- 1) ч, а затем фильтруют
в термостате при той же температуре. Срок хранения основного
раствора метиленового голубого в термостате при температуре (37 +/-
1) град. С не более 3 месяцев при условии герметичной укупорки.
Приготовление рабочего раствора метиленового голубого.
Основной раствор помещают в водяную баню при температуре (45 +/-
1) град. С на (8 +/- 2) мин., перемешивают до полного растворения
кристаллов. Затем быстро охлаждают до температуры (20 +/- 1) град.
С и 5,0 куб. см этого раствора прибавляют к 195,0 куб. см
дистиллированной кипяченой воды. Смесь хорошо перемешивают. Срок
хранения рабочего раствора метиленового голубого - не более 7
суток при температуре от 8 до 10 град. С.
Приготовление раствора метиленового голубого для окраски
препаратов.
К 30,0 куб. см основного спиртового раствора метиленового
голубого прибавляют 100,0 куб. см дистиллированной воды и 1,0 куб.
см раствора гидроокиси калия с массовой концентрацией 10 г/куб.
дм.
6.1.10. Приготовление карболового раствора
кристаллического фиолетового для окраски препаратов
1 г красителя кристаллического фиолетового растирают в ступке с
2 г кристаллической карболовой кислоты до кашицы, прибавляют
небольшими порциями 10,0 куб. см 96-процентного этилового спирта.
Доводят объем до 100 куб. см дистиллированной водой. Таким образом
получают основной раствор для приготовления рабочего раствора.
К 10,0 куб. см основного карболового раствора кристаллического
фиолетового добавляют 90,0 куб. см дистиллированной воды.
Тщательно перемешивают.
Растворы хранят в темном флаконе под притертой пробкой.
6.1.11. Мясо - пептонный бульон
Говяжье мясо, освобожденное от жира и сухожилий, пропускают
через мясорубку, взвешивают, складывают в кастрюлю, смешивают с
двойным количеством водопроводной воды и оставляют на (18 +/- 6) ч
при температуре (5 +/- 1) град. С. Для ускорения процесса
выделения питательных веществ из мяса содержимое кастрюли
подогревают при температуре (50 +/- 5) град. С в течение (1 +/-
0,1) ч и затем кипятят (35 +/- 5) мин. После кипячения бульон в
горячем состоянии фильтруют через двойной бумажный фильтр.
Фильтрат доводят питьевой водой до первоначального объема,
добавляют к нему (1,0 +/- 0,1)-процентного пептона и (0,5 +/- 0,1)-
процентного хлористого натрия. Устанавливают с помощью 1H раствора
гидроокиси натрия активную кислотность (7,3 +/- 0,1) ед. pH.
Приготовленный бульон разливают в колбы и стерилизуют при (121 +/-
1) град. С в течение (20 +/- 1) мин.
6.1.12. Мясо - пептонный агар
К 1,0 куб. дм мясо - пептонного бульона или перевара
Хоттингера, с концентрацией аминного азота не менее 100 мг/л
добавляют 15 г мелко нарезанного агара в волокнах или порошке.
После 10 - 15 - минутного набухания агар - агара смесь кипятят при
постоянном помешивании до полного его растворения. Полученную
среду после установления активной кислотности (7,3 +/- 0,1) ед. pH
фильтруют в горячем виде через ватно - марлевый фильтр, разливают
во флаконы и пробирки и стерилизуют при (121 +/- 1) град. С в
течение 20 мин.
6.2. Специальные питательные среды и реактивы
6.2.1. Среды для определения общего
количества мезофильных аэробных и факультативно -
анаэробных микроорганизмов
6.2.1.1. Среда для определения аэробных и факультативно -
анаэробных микроорганизмов.
Сухой питательный агар промышленного
производства (на основе килечного
гидролизата) - 35 г
Экстракт кормовых дрожжей (ЭКД) - 2,5 г
Глюкоза - 1,0 г
Вода дистиллированная - до 1000,0 куб. см
pH - 7,0
Стерилизация в автоклаве при (121 +/- 1) град. С в течение (20
+/- 1) мин.
6.2.1.2. Сухие питательные среды промышленного производства по
ТУ 49513-83 или по ТУ 10-02-02-789-177-94.
Подготовку сред для посевов проводят согласно прописи на
этикетке.
|
