Утверждаю
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации,
Первый заместитель
Министра здравоохранения
Российской Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
27 декабря 1999 года
Дата введения -
с момента утверждения
4. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.
БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
МЕТОДЫ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО КОНТРОЛЯ
ПАРФЮМЕРНО-КОСМЕТИЧЕСКОЙ ПРОДУКЦИИ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
МУК 4.2.801-99
1. Разработаны: Федеральным центром Госсанэпиднадзора Минздрава
России (Подунова Л.Г., Кривопалова Н.С., Стреляева Н.Е.), Научно-
производственным центром "Гидробиос" Федерального управления
медико-биологических и экстремальных проблем при Минздраве России
(Герасимова Г.А., Синилов С.К., Бутова Л.Г., Критская И.В.),
Научно-исследовательским институтом медицины труда РАМН
(Просветова Н.К., Александрова Л.З., Иванова Л.А., Фролова Я.А.).
2. Утверждены и введены в действие Главным государственным
санитарным врачом Российской Федерации - Первым заместителем
Министра здравоохранения Российской Федерации 27 декабря 1999 г.
3. Введены впервые.
1. Общие положения
1.1. Настоящие Методические указания предназначены для
обеспечения контроля качества парфюмерно-косметических изделий по
микробиологическим показателям, введенным СанПиН 1.2.631-97
"Гигиенические требования к производству и безопасности парфюмерно-
косметической продукции", и устанавливают методы лабораторных
испытаний качества парфюмерно-косметической продукции по
микробиологическим показателям безопасности для здоровья человека,
проводимых в порядке производственного контроля, государственного
санитарно-эпидемиологического надзора и при испытании указанной
продукции в целях сертификации соответствия.
1.2. Методические указания предназначены для использования в
аккредитованных бактериологических производственных, испытательных
лабораториях и лабораториях организаций государственной санитарно-
эпидемиологической службы Российской Федерации и позволяют
проводить контроль на соответствие СанПиН 1.2.631-97
"Гигиенические требования к производству и безопасности парфюмерно-
косметической продукции".
1.3. Данный документ разработан в связи с необходимостью
унификации и усовершенствования методов микробиологического
анализа парфюмерно-косметической продукции.
Методы адаптированы к условиям работы лабораторий,
осуществляющих контроль качества и безопасности парфюмерно-
косметической продукции.
1.4. Настоящие Методические указания должны учитываться при
пересмотре действующей и разработке вновь создаваемой нормативной
документации на парфюмерно-косметическую продукцию.
2. Нормативные ссылки
2.1. Закон Российской Федерации "О санитарно-эпидемиологическом
благополучии населения" от 30.03.99 N 52-ФЗ.
2.2. Положение о государственном санитарно-эпидемиологическом
нормировании, утвержденное Постановлением Правительства Российской
Федерации от 15.06.94 N 625.
2.3. Положение о государственной санитарно-эпидемиологической
службе РФ, утвержденное Постановлением Правительства Российской
Федерации от 30.06.98 N 680.
3. Методы отбора и подготовки проб
для микробиологического анализа
3.1. Отбор проб
3.1.1. При отборе проб следует руководствоваться требованиями
ГОСТ 29188.0-91 "Парфюмерно-косметические изделия. Правила
приемки, отбор проб, методы органолептических испытаний" и ГОСТ
26668-85 "Продукты пищевые. Методы отбора проб для
микробиологических анализов".
3.1.2. Пробы парфюмерно-косметических изделий для
микробиологического анализа отбирают до отбора проб для физико-
химических, органолептических и других видов испытаний с
соблюдением правил асептики, для того чтобы исключить вторичное
микробное загрязнение продукта.
3.1.3. От каждой партии парфюмерно-косметических изделий,
подлежащих контролю, следует брать не менее трех единиц изделий в
потребительской таре (упаковке), которая не должна иметь следов
повреждений.
3.1.4. При испытаниях на стерильность от каждой партии
парфюмерно-косметических изделий, независимо от ее объема,
отбирают 10 ампул или 10 других единиц упаковки.
3.1.5. Пробу, отобранную от отдельной единицы упаковки,
называют разовой. Количество продукта в разовых пробах из каждой
единичной упаковки должно быть одинаковым. Разовые пробы
соединяют, перемешивают и составляют среднюю пробу.
3.2. Подготовка проб к анализу
3.2.1. Подготовка проб для определения
микробиологической чистоты
3.2.1.1. Перед вскрытием упаковки место соединения крышки с
тарой обрабатывают 70%-ным раствором этилового спирта. Первую
порцию в количестве примерно 10% содержимого упаковки отбрасывают,
затем отбирают пробы и переносят в стерильную колбу или флакон
вместимостью 100 - 200 куб. см.
3.2.1.2. Для испытания готовят среднюю пробу не менее 15 г
(куб. см) из упаковок, отобранных по п. 3.1.3, и состоящую из
равных разовых проб. Такое же количество упаковок используют и для
повторных испытаний. В случае, если масса (объем) парфюмерно-
косметического средства в единичной упаковке менее 5 г (куб. см),
содержимое исследуют полностью или используют большее количество
упаковок.
3.2.1.3. (5,0 +/- 0,1) г (куб. см) или (10,0 +/- 0,1) г (куб.
см) средней пробы отбирают стерильно и помещают в стеклянные колбы
или флаконы, содержащие соответственно (45 +/- 1) куб. см или (90
+/- 1) куб. см 1%-ного раствора твина-80 в физиологическом
растворе (п. 6.4.2). Смесь тщательно перемешивают в течение 15 -
30 мин. до полной гомогенизации (либо помещают на аппарат для
встряхивания). При необходимости пробы прогревают на водяной бане
или в термостате до 40 - 45 -С, но не более 10 мин. Для
гомогенизации продукции, плохо растворимой в воде, используют
стеклянные бусы.
Эмульсии типа вода-масло подготавливают аналогичным способом,
используя 4%-ный раствор твина-80 в физиологическом растворе (п.
6.4.2) и предварительно (до встряхивания) прогревая на водяной
бане или в термостате до 40 - 45 -С в течение 20 мин.
Получают смесь, в 10 г (куб. см) которой содержится 1 г (куб.
см) парфюмерно-косметического средства - первое разведение 1:10
-1
(10 ). При необходимости делают последующие десятикратные 1:100
-2 -3
(10 ) и 1:1000 (10 ) разведения.
3.2.1.4. Полученные разведения используют для посевов. Время с
момента окончания подготовки пробы до начала высева не должно
превышать 30 мин.
3.2.1.5. Определение собственной антимикробной активности
парфюмерно-косметической продукции.
Метод основан на подавлении роста тест-штаммов микроорганизмов
под действием испытуемого парфюмерно-косметического средства. В
качестве тест-штаммов используют Bacillus subtilis АТСС 6633 (или
Bacillus cereus АТСС 10702), Escherichia coli АТСС 25922,
Pseudomonas aeruginosa АТСС 9027 (или Pseudomonas aeruginosa ГИСК
453), Staphylococcus aureus АТСС 6538-Р и культуру Candida
albicans АТСС 885-653.
Определение собственной антимикробной активности проводится для
парфюмерно-косметических средств, в состав которых входят
консерванты и другие вещества, обладающие антимикробным действием.
Собственная антимикробная активность определяется однократно
для каждой конкретной рецептуры парфюмерно-косметического
средства.
Культуры Bacillus subtilis (Bacillus cereus), Escherichia coli,
Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus выращивают на одной
из жидких сред по п. 6.4.11.1 или п. 6.4.11.2 при температуре (37
+/- 1) -С в течение (19 +/- 1) ч. Культуру Candida albicans
выращивают на жидкой среде Сабуро по п. 6.4.8.1 при температуре
(30 +/- 1) -С в течение (48 +/- 3) ч.
Из каждой выросшей культуры готовят взвесь микроорганизмов,
добавляя физиологический раствор по п. 6.4.1 в соотношении 1:1000.
В пробирки вносят по 1 куб. см первого разведения испытуемой
пробы парфюмерно-косметического средства по п. 3.2.1.3 и
добавляют:
- в пробирку N 1 - 10 куб. см буферного раствора по п. 6.4.16 и
1 куб. см взвеси Bacillus subtilis (Bacillus cereus);
- в пробирку N 2 - 10 куб. см буферного раствора по п. 6.4.16 и
1 куб. см взвеси Candida albicans;
- в пробирку N 3 - 10 куб. см одной из питательных сред по п.
6.4.9 и 1 куб. см взвеси Escherichia coli;
- в пробирку N 4 - 10 куб. см одной из питательных сред по п.
6.4.11 и 1 куб. см взвеси Pseudomonas aeruginosa;
- в пробирку N 5 - 10 куб. см одной из питательных сред по п.
6.4.13 и 1 куб. см взвеси Staphylococcus aureus.
Контролем служат пробирки с питательными средами и
соответствующими тест-штаммами, в которые вместо испытуемого
парфюмерно-косметического средства вносят то же количество
стерильной дистиллированной воды.
Посевы инкубируют при (30 +/- 1) -С в течение (48 +/- 3) ч.
В случае отсутствия роста тест-штаммов микроорганизмов на
соответствующих питательных средах отмечают антимикробное действие
испытуемого средства.
Для устранения антимикробного действия входящих в состав
парфюмерно-косметических средств консервантов или веществ,
обладающих антимикробным действием, среднюю пробу в количестве
(5,0 +/- 0,1) г (куб. см) или (10,0 +/- 0,1) г (куб. см) отбирают
стерильно и помещают в стеклянные колбы или флаконы, содержащие
соответственно (45 +/- 1) куб. см или (90 +/- 1) куб. см 4%-ного
раствора твина-80 в физиологическом растворе, или увеличивают
разведение испытуемой пробы.
Дальнейшие испытания проводят в соответствии с п. 4.
3.2.2. Подготовка проб к анализу на стерильность
Испытание парфюмерно-косметических средств на стерильность
проводят методом прямого посева или методом мембранных фильтров.
Метод мембранных фильтров не применим для суспензий или
гомогенатов парфюмерно-косметических средств, загрязняющих при
фильтрации поры фильтров.
3.2.2.1. Перед вскрытием ампулы с парфюмерно-косметической
продукцией обрабатываются этиловым спиртом. Шейка ампулы осторожно
прогревается в пламени горелки. На хорошо прогретую шейку ампулы
капают 1 каплю стерильного физиологического раствора (п. 6.4.1).
Ампулы осторожно вскрывают по месту образовавшейся в стекле
трещины.
3.2.2.2. Содержимое 10 ампул или 10 других упаковок объединяют
в единую пробу. Из объединенной пробы отбирают стерильно (5,0 +/-
0,1) г (куб. см) или (10,0 +/- 0,1) г (куб. см) парфюмерно-
косметического средства.
При испытаниях методом прямого посева отобранные пробы
непосредственно засевают в соответствующие питательные среды.
При испытаниях методом мембранных фильтров отобранные пробы
помещают в стеклянные колбы или флаконы, содержащие соответственно
(45 +/- 1) куб. см или (90 +/- 1) куб. см стерильного 1%-ного
раствора твина-80 в физиологическом растворе, предварительно
пропущенного через мембранный фильтр с размером пор (0,45 +/-
0,02) мкм. Пробы тщательно перемешивают в течение 15 - 20 мин. до
полной гомогенизации.
При испытании масляных растворов пробы подготавливают
аналогичным способом, используя 4%-ный раствор твина-80 в
физиологическом растворе и предварительно (до встряхивания)
прогревая на водяной бане или в термостате до 40 - 45 -С в течение
20 мин.
4. Методы анализа
При микробиологическом контроле парфюмерно-косметической
продукции используют стандартизованные методы микробиологического
посева. Определяют следующие группы микроорганизмов: мезофильные
аэробные и факультативно-анаэробные микроорганизмы; дрожжи,
дрожжеподобные и плесневые грибы; бактерии семейства
Enterobacteriaceae; бактерии вида Staphylococcus aureus; бактерии
вида Pseudomonas aeruginosa.
В микробиологических лабораториях, осуществляющих контроль
качества и безопасности парфюмерно-косметической продукции,
допускается применение импедансного метода в соответствии с
Методическими указаниями МУК 4.2.590-96 "Бактериологические
исследования с использованием экспресс-анализатора "Бак Трак
4100", утвержденными 18.11.96 Государственным комитетом санитарно-
эпидемиологического надзора. Использование прибора "Бак Трак 4100"
позволяет сократить время испытаний и получить результат через 6 -
8 ч после начала исследований. Прибор аттестован и внесен в
Государственный реестр (N 14313-94).
4.1. Определение общего количества мезофильных
аэробных и факультативно-анаэробных бактерий
4.1.1. Сущность метода
Метод основан на выявлении и количественном подсчете всех
выросших колоний микроорганизмов при культивировании посевов в
аэробных условиях при температуре (30 +/- 1) -С в течение (72 +/-
3) ч в пересчете их количества на 1 г (куб. см) исследуемого
продукта.
4.1.2. Проведение анализа
Для определения общего количества мезофильных аэробных и
факультативно-анаэробных бактерий выбирают те разведения, при
посеве которых на чашках вырастает не менее 15 и не более 300
колоний.
Посев осуществляют глубинным или двухслойным агаровым методами.
4.1.2.1. Метод глубинного посева
По 1 куб. см исследуемого материала из разведений,
приготовленных по п. 3.2.1.3, высевают параллельно в две чашки
Петри для каждого разведения. При посеве крышку чашки Петри слегка
приоткрывают и посевной материал вносят на дно чашки. Не позже чем
через 15 мин. после внесения материала, его заливают 15 - 20 куб.
см одной из сред по п. 6.4.7, предварительно расплавленной и
охлажденной до температуры (45 +/- 1) -С. Чашки с посевами,
залитыми питательной средой, осторожно вращают, чтобы посевной
материал равномерно распределился по всей питательной среде. Затем
чашки с посевами оставляют на горизонтальной поверхности до
полного застывания питательной среды.
После застывания среды чашки помещают в термостат вверх дном и
термостатируют при температуре (30 +/- 1) -С в течение (72 +/- 3)
ч.
4.1.2.2. Двухслойный агаровый метод
По 1 куб. см исследуемого материала из разведений,
приготовленных по п. 3.2.1.3, вносят в каждую из двух пробирок с 4
куб. см одной из сред по п. 6.4.7, предварительно расплавленной и
охлажденной до температуры (45 +/- 1) -С. Быстро перемешивают
содержимое пробирок и переносят в чашки Петри с застывшей средой,
распределяя его равномерно по поверхности среды.
После застывания среды чашки помещают в термостат вверх дном и
термостатируют при температуре (30 +/- 1) -С в течение (72 +/- 3)
ч.
4.1.2.3. Обработка результатов
Просмотр посевов осуществляется каждый день.
Результаты оцениваются по каждой пробе отдельно.
Подсчитывают количество колоний на тех чашках, где их выросло
от 15 до 300, суммируют и находят среднее арифметическое из них.
Допускается учитывать колонии с помощью лупы с 5х увеличением.
Полученное среднее арифметическое число колоний округляют
следующим образом:
- если число меньше 100 - его округляют до ближайшего числа,
кратного 5;
- если число больше 100 и его последняя цифра 5 - его округляют
до ближайшего числа, кратного 20;
- если число больше 100 и его последняя цифра не 5 - его
округляют до ближайшего числа, кратного 10.
Количество микроорганизмов в 1 г продукта (Х) вычисляют по
формуле:
N
Х = а х 10 / q,
где:
а - округленное среднее арифметическое число колоний;
q - объем посевного материала, внесенного в чашку, куб. см;
N - степень десятикратного разведения продукта.
Результаты анализа выражаются числом от 1,0 до 9,9, умноженным
N
на 10 , где N - соответствующая степень десятикратного разведения
продукта.
Если на чашках с разведением 1:10 не обнаружено роста
1
бактерий, то результат записывают так: менее 1,0 х 10 клеток на
1 г (куб. см).
Если на чашках выросло более 300 колоний, то посевы повторяют,
используя более высокие разведения продукта.
4.2. Определение количества дрожжей, дрожжеподобных
и плесневых грибов
4.2.1. Сущность метода
Метод основан на выявлении и количественном подсчете всех
выросших колоний микроорганизмов, типичных по макро- и (или)
микроскопической морфологии, на селективной агаризованной
питательной среде Сабуро, при культивировании посевов при
температуре (30 +/- 1) -С в течение (120 +/- 3) ч.
4.2.2. Проведение анализа
Для определения количества дрожжей и плесневых грибов выбирают
те разведения, при посеве которых на чашках вырастает не менее 15
и не более 150 колоний для дрожжей и не менее 5 и не более 50 -
для плесеней.
Посев осуществляют глубинным или двухслойным агаровым методами.
4.2.2.1. Метод глубинного посева
По 1 куб. см исследуемого материала из разведений,
приготовленных по п. 3.2.1.3, высевают параллельно в две чашки
Петри для каждого разведения. При посеве крышку чашки Петри слегка
приоткрывают и посевной материал вносят на дно чашки. Не позже чем
через 15 мин. после внесения материала его заливают 15 - 20 куб.
см предварительно расплавленной и охлажденной до температуры (45
+/ -1) -С агаризованной среды Сабуро по п. 6.4.8. Чашки с
посевами, залитыми питательной средой, осторожно вращают, чтобы
посевной материал равномерно распределился по всей питательной
среде. Затем чашки с посевами оставляют на горизонтальной
поверхности до полного застывания питательной среды.
После застывания среды чашки помещают в термостат вверх дном и
инкубируют при температуре (30 +/- 1) -С в течение (120 +/- 3) ч.
4.2.2.2. Двухслойный агаровый метод
По 1 куб. см исследуемого материала из разведений,
приготовленных по п. 3.2.1.3, вносят в каждую из двух пробирок с 4
куб. см предварительно расплавленной и охлажденной до температуры
(45 +/- 1) -С агаризованной среды Сабуро. Быстро перемешивают
содержимое пробирок и переносят в чашки Петри с застывшей
агаризованной средой Сабуро, распределяя его равномерно по
поверхности среды.
После застывания среды чашки помещают в термостат вверх дном и
инкубируют при температуре (30 +/- 1) -С в течение (120 +/- 3) ч.
4.2.2.3. Обработка результатов
Результаты оцениваются по каждой пробе отдельно.
Просмотр посевов осуществляется каждый день, предварительный
учет типичных колоний проводят через (72 +/- 3) ч
термостатирования посевов, а окончательный - через (120 +/- 3) ч.
На поверхности плотной среды рост и развитие дрожжей и
дрожжеподобных грибов характеризуется появлением плоских или
выпуклых колоний белого или кремового, иногда серо-белого цвета. В
глубине агара дрожжи образуют чечевицеобразные колонии.
Развитие плесневых грибов характеризуется появлением
сметанообразных, слизистых колоний различной окраски с последующим
опушением.
Подсчитывают все выросшие колонии, суммируют и находят среднее
арифметическое из них.
Допускается учитывать колонии с помощью лупы с 5х увеличением.
Полученное среднее арифметическое число колоний, если
необходимо, округляют как описано в п. 4.1.2.3.
Количество дрожжей и плесневых грибов в 1 г (куб. см) продукта
(Х) вычисляют по формуле:
N
Х = а х 10 / q,
где:
а - округленное среднее арифметическое число колоний;
q - объем посевного материала, внесенного в чашку, куб. см;
N - степень десятикратного разведения продукта.
Результаты анализа выражаются числом от 1,0 до 9,9, умноженным
N
на 10 , где N - соответствующая степень десятикратного разведения
продукта.
Если на чашках с разведением 1:10 не обнаружено роста дрожжей и
плесневых грибов, то результат записывают так: "не обнаружены".
Если на чашках выросло более 150 колоний, то посевы повторяют,
используя более высокие разведения продукта.
4.3. Выявление и идентификация бактерий
сем. Enterobacteriaceae
К семейству Enterobacteriaceae относятся грамотрицательные
неспорообразующие палочки, которые дают отрицательную оксидазную
реакцию, ферментируют глюкозу с образованием кислоты и
восстанавливают нитраты в нитриты.
4.3.1. Сущность метода
Метод основан на выявлении бактерий семейства
Enterobacteriaceae с использованием накопительных и селективных
питательных сред с дальнейшей идентификацией выявленных бактерий
по нижеследующим биохимическим тестам.
4.3.2. Проведение испытания
-1
10 куб. см исследуемого материала из разведения 10,
приготовленного по п. 3.2.1.3, вносят в стеклянный флакон
вместимостью 200 куб. см, содержащий 100 куб. см одной из
питательных сред по п. 6.4.9. Смесь перемешивают и инкубируют при
температуре (37 +/- 1) -С в течение (24 - 48 +/- 3) ч.
При наличии признаков роста на средах накопления (помутнение
среды, изменение ее цвета) делают пересев петлей на чашки Петри со
средой Эндо (п. 6.4.10.1). Посевы инкубируют при температуре (37
+/- 1) -С в течение (24 - 48 +/- 3) ч.
На среде Эндо бактерии семейства Enterobacteriaceae образуют
колонии круглые, малиновые с металлическим блеском или без него,
розовые, бесцветные, блестящие, выпуклые, диаметром 1 - 4 мм.
При окраске по Граму наблюдаются грамотрицательные
неспорообразующие палочки.
При отсутствии роста на среде Эндо типичных для семейства
Enterobacteriaceae колоний считают, что в образце нет
представителей данного семейства.
Колонии, подозрительные по морфологии (каждую отдельно),
пересевают петлей на одну из скошенных сред по п. 6.4.7. Посевы
инкубируют при (37 +/- 1) -С в течение (24 +/- 3) ч. Культуры
проверяют на чистоту.
Чистые культуры исследуют на наличие фермента цитохромоксидазы,
для чего полоску фильтровальной бумаги смачивают реактивом на
обнаружение цитохромоксидазы (п. 6.4.6) и наносят
бактериологической петлей или стеклянной палочкой суточную чистую
культуру исследуемых бактерий. Синее окрашивание, появляющееся
через 2 - 5 мин., свидетельствует о положительной оксидазной
реакции.
При отрицательной оксидазной реакции культуры пересевают петлей
на среду для определения ферментации глюкозы по п. 6.4.10.2
(допускается использование О/F-теста) и в среду для определения
способности восстанавливать нитраты в нитриты по п. 6.4.10.3.
В половину пробирок со средой для определения ферментации
глюкозы вносят по 0,5 куб. см стерильного вазелинового масла.
Посевы инкубируют при (37 +/- 1) -С в течение (24 +/- 3) ч. При
наличии роста ферментацию глюкозы устанавливают по изменению цвета
среды из красного в желтый в пробирках с маслом и без него.
При проведении О/F-теста посев производят уколом в два столбика
со средой Хью-Лейфсена по п. 6.4.10.4, один из которых заливают 1
куб. см стерильного вазелинового масла. Посевы инкубируют при (37
+/- 1) -С в течение (24 +/- 3) ч. При положительной реакции
происходит изменение цвета среды при культивировании как в
аэробных, так и в анаэробных условиях.
О наличии нитритов в среде судят по появлению красного
окрашивания при внесении в среду реактива Грисса (п. 6.4.5). Для
чего к суточной исследуемой культуре на среде для определения
наличия нитритов приливают 0,2 - 0,3 куб. см реактива Грисса,
погружая пипетку до дна пробирки. Появление красного окрашивания
свидетельствует о наличии нитритов.
4.3.3. Обработка результатов
Если в исследуемом образце обнаружены грамотрицательные
неспорообразующие палочки, которые дают отрицательную оксидазную
реакцию, ферментируют глюкозу с образованием кислоты и
восстанавливают нитраты в нитриты, это значит, что парфюмерно-
косметическое средство контаминировано бактериями сем.
Enterobacteriaceae.
4.4. Выявление и идентификация Pseudomonas aeruginosa
Микроорганизмы вида Pseudomonas aeruginosa представляют собой
грамотрицательные неспорообразующие палочки, которые дают
положительную оксидазную реакцию, образуют проникающий в субстрат
пигмент феназинового ряда, имеющий буроватый оттенок с вариантами
от сине-зеленого (пиоцианин) до коричнево-красного, и способны к
росту при температуре (42 +/- 1) -С.
4.4.1. Сущность метода
Метод основан на выявлении бактерий вида Pseudomonas aeruginosa
с использованием накопительных и селективных питательных сред с
дальнейшей идентификацией выявленных бактерий по нижеследующим
биохимическим тестам.
4.4.2. Проведение испытаний
-1
10 куб. см исследуемого материала из разведения 10 ,
приготовленного по п. 3.2.1.3, вносят в стеклянный флакон
вместимостью 200 куб. см, содержащий 100 куб. см одной из
питательных сред по п. 6.4.11. Смесь перемешивают и инкубируют
при температуре (37 +/- 1) -С в течение (24 - 48 +/- 3) ч.
При наличии признаков роста в среде накопления делают пересев
петлей на чашки с одной из питательных сред по п. 6.4.7. Посевы
инкубируют при температуре (37 +/- 1) -С в течение (24 - 48 +/- 3)
ч.
При наличии роста зеленоватых, флюоресцирующих колоний,
обладающих характерным запахом и окрашивающих среду, из них делают
мазки и окрашивают по Граму.
Колонии, подозрительные по морфологии (каждую отдельно),
пересевают петлей на одну из скошенных сред по п. 6.4.7. Посевы
инкубируют при (37 +/- 1) -С в течение (24 +/- 3) ч. Культуры
проверяют на чистоту.
Чистые культуры колоний исследуют на наличие цитохромоксидазы.
Для чего полоску фильтровальной бумаги смачивают реактивом на
обнаружение цитохромоксидазы (п. 6.4.6) и наносят
бактериологической петлей или стеклянной палочкой суточную чистую
культуру исследуемых бактерий. Синее окрашивание, появляющееся
через 2 - 5 мин., свидетельствует о положительной оксидазной
реакции.
Оксидазоположительные колонии пересевают петлей на среду Кинг-А
(п. 6.4.12) и инкубируют при температуре (37 +/- 1) -С в течение
(24 - 48 +/- 3) ч.
На среде Кинг-А культура Pseudomonas aeruginosa образует
пигмент феназинового ряда, имеющий буроватый оттенок с вариантами
от сине-зеленого (пиоцианин) до коричнево-красного и проникающий в
субстрат.
Для дополнительного подтверждения принадлежности в виду
Pseudomonas aeruginosa чашки со средой Кинг-А инкубируют при
температуре (42 +/- 1) -С в течение (24 +/- 3) ч.
Культура Pseudomonas aeruginosa растет в вышеуказанных условиях
с образованием сине-зеленого пигмента.
4.4.3. Обработка результатов
Если в результате исследований обнаружены колонии
грамотрицательных неспорообразующих палочек, дающих положительную
оксидазную реакцию, образующие пигмент или без него и дающие рост
при 42 -С, считают, что парфюмерно-косметическое средство
контаминировано Pseudomonas aeruginosa.
4.5. Выявление и идентификация Staphylococcus aureus
Микроорганизмы вида Staphylococcus aureus представляют собой
грамположительные кокки, обладающие лецитиназной активностью,
сбраживающие маннит в аэробных и анаэробных условиях или мальтозу
в анаэробных условиях и дающие положительную реакцию
плазмокоагуляции.
4.5.1. Сущность метода
Метод основан на выявлении бактерий вида Staphylococcus aureus
с использованием накопительных и селективных питательных сред с
дальнейшей идентификацией выявленных бактерий по нижеследующим
биохимическим тестам.
4.5.2. Проведение испытаний
-1
10 куб. см исследуемого материала из разведения 10 ,
приготовленного по п. 3.2.1.3, вносят в стеклянный флакон
вместимостью 200 куб. см, содержащий 100 куб. см одной из
питательных сред по п. 6.4.13. Смесь перемешивают и инкубируют
при температуре (37 +/- 1) -С в течение (24 - 48 +/- 3) ч.
При наличии признаков роста делают пересев петлей на чашки с
одной из сред: п. 6.4.14.1 - желточно-солевой агар или п. 6.4.14.2
- Байрд-Паркер агар, или п. 6.4.14.3 - маннитно-солевой агар.
Посевы на желточно-солевой и Байрд-Паркер агар инкубируют при
температуре (37 +/- 1) -С в течение (48 +/- 3) ч, а посевы на
маннитно-солевой агар - в течение (24 - 48 +/- 3) ч.
При росте на желточно-солевом агаре Staphylococcus aureus
образует круглые, слегка возвышающиеся над поверхностью агара
колонии с ровными краями диаметром 2 - 2,5 мм, окрашенные в
желтый, золотистый, кремовый, палевый или белый цвет, окруженные
зоной лецитиназной активности.
На среде Байрд-Паркер Staphylococcus aureus растет в виде
черных блестящих колоний диаметром 1 - 1,5 мм, окруженных зоной
лецитиназной активности.
Наличие на маннитно-солевом агаре колоний, окруженных желтыми
зонами, свидетельствует о способности этих микроорганизмов
ферментировать маннит.
Из подозрительных по морфологии колоний делают мазки и
окрашивают по Граму. Стафилококки по Граму окрашиваются
положительно, имеют шарообразную или близкую к ней форму с
диаметром 0,6 - 1,0 мкм и располагаются обычно в виде скоплений,
напоминающих гроздья винограда.
При обнаружении грамположительных кокков делают пересев на одну
из скошенных сред, приготовленных по п. 6.4.7. Посевы инкубируют
при (37 +/- 1) -С в течение (24 +/- 3) ч.
Выделенную чистую культуру пересевают в среду Гисса с маннитом
или мальтозой по п. 6.4.14.4, разлитую высоким столбиком (посев
производят уколом). Инкубируют при (37 +/- 1) -С в течение (24 +/-
3) ч.
В случае роста стафилококков на среде Гисса с маннитом или
мальтозой наблюдается ферментация или окисление углевода,
сопровождающиеся изменением цвета среды.
Выделенную чистую культуру исследуют на наличие фермента
плазмокоагулазы.
Для проведения реакции в стерильную пробирку с 0,5 - 1,0 куб.
см плазмы крови кролика, разведенной в 3 - 4 раза или
приготовленной из сухого препарата промышленного производства,
вносят одну петлю суточной агаровой культуры. Одну пробирку с
плазмой крови оставляют незасеянной для контроля. Содержимое
пробирок перемешивают и инкубируют при (37 +/- 1) -С в течение (24
+/- 3) ч. Результат учитывают через 2, 4, 6 и 24 ч.
При отсутствии свертывания плазмы через 24 ч исследуемую
культуру относят к коагулазоотрицательной.
Реакцию считают положительной при образовании даже небольшого
сгустка.
4.5.3. Обработка результатов
Если в результате исследований обнаружены колонии
грамположительных кокков, ферментирующие маннит в аэробных и
анаэробных условиях или мальтозу в анаэробных условиях, обладающие
лецитиназной активностью и дающие положительную реакцию
плазмокоагуляции, считают, что парфюмерно-косметическое средство
контаминировано Staphylococcus aureus.
4.6. Испытание на стерильность
4.6.1. Метод прямого посева
4.6.1.1. Сущность метода
Метод основан на способности основного большинства как
аэробных, так и анаэробных бактерий давать видимый рост на
тиогликолевой среде, а дрожжей, дрожжеподобных и плесневых грибов
на среде Сабуро.
4.6.1.2. Проведение испытания
Из объединенной пробы, приготовленной по п. 3.2.2.2, отбирают
стерильно по (5,0 +/- 0,1) г (куб. см) или (10,0 +/- 0,1) г (куб.
см) испытуемого средства и высевают в два стеклянных флакона
(параллельные определения) вместимостью 100 или 200 куб. см,
содержащие 50 или 100 куб. см жидкой среды Сабуро по п. 6.4.8.1 и
50 или 100 куб. см тиогликолевой среды по п. 6.4.15
соответственно.
Посевы в среде Сабуро инкубируют при температуре (30 +/- 1) -С,
а посевы в тиогликолевой среде при температуре (30 - 35) -С в
течение 14 сут. Посевы просматривают ежедневно.
4.6.3. Метод мембранных фильтров
4.6.3.1. Сущность метода
Метод мембранных фильтров основан на фильтрации растворов через
мембранные фильтры с размером пор не более (0,45 +/- 0,02) мкм, на
которых улавливается основное количество микроорганизмов, с
последующим культивированием их в тиогликолевой среде и в жидкой
среде Сабуро.
4.6.3.2. Проведение испытания
Фильтрование проводят в стерильных условиях с использованием
фильтрационной установки, включающей фильтродержатель, соединенный
с колбой приемником. Фильтродержатель состоит из воронки с крышкой
и основания из пористой пластины, на которую помещается мембранный
фильтр.
Фильтрационную установку стерилизуют любым способом,
обеспечивающим сохранность рабочих характеристик мембран, а также
стерильность мембран и всей установки.
Для фильтрации используют нитратцеллюлозные мембранные фильтры
с размером пор (0,45 +/- 0,02) мкм, диаметром около 47 мм
(мембрана "Владипор" типа МФАС-Б5 или МФА-МА-N5 или другие,
удовлетворяющие требованиям).
Фильтрование проводят под вакуумом 93,3 кПа (70 мм рт. ст.).
Для фильтрования продуктов, содержащих небольшое количество
взвешенных частиц, используют предварительную фильтрацию через
префильтр. В качестве префильтров можно использовать фильтры типа
АР 15 (Millipore), картон для предварительной фильтрации марки
КФБЖ, картон для предварительной фильтрации марки КФМП и другие
материалы, способные эффективно задерживать твердые частицы.
Пробу, подготовленную по п. 3.2.2.2, немедленно фильтруют.
Фильтрацию заканчивают в момент исчезновения влаги на поверхности
фильтра. После окончания фильтрации мембрану отмывают 3 - 5
порциями по 100 куб. см стерильного физиологического раствора для
полного удаления с поверхности фильтра веществ, препятствующих
росту микроорганизмов.
После отмывания мембрану немедленно извлекают из
фильтродержателя, разрезают стерильными ножницами пополам и одну
половину помещают в стеклянный флакон вместимостью 100 или 200
куб. см, содержащий 50 или 100 куб. см жидкой среды Сабуро по п.
6.1.9.1, а вторую половину - в стеклянный флакон, содержащий 50
или 100 куб. см тиогликолевой среды по п. 6.1.16 соответственно.
Посевы в среде Сабуро инкубируют при температуре (30 +/- 1) -С,
а посевы в тиогликолевой среде - при температуре 30 - 35 -С в
течение 7 сут. Посевы просматривают ежедневно.
4.6.4. Обработка результатов
Посевы просматривают в рассеянном свете ежедневно и по
окончании периода инкубации. Наличие роста микроорганизмов в
питательных средах оценивают визуально по появлению мутности
пленки, осадка и других макроскопических изменений. Выявленные
рост микроорганизмов подтверждают микроскопированием.
Испытуемая продукция считается стерильной при отсутствии роста
микроорганизмов.
При обнаружении роста хотя бы в одном флаконе его подтверждают
микроскопированием и повторяют испытание на таком же количестве
образцов, как и в первый раз. В случае роста при повторном
испытании микроорганизмов, морфологически сходных с
микроорганизмами, выявленными при первичном посеве, испытуемую
продукцию считают нестерильной. Если при повторном посеве
наблюдается рост микроорганизмов, отличающихся по морфологии от
первоначально выделенных, испытание проводят в третий раз на
удвоенном количестве образцов. При наличии роста хотя бы в одном
флаконе при третьем испытании косметическую продукцию считают
нестерильной.
5. Микробиологические нормативы
для парфюмерно-косметической продукции
Микробиологическому контролю подлежат средства для ухода за
кожей лица и тела (косметические кремы, кремообразные маски,
косметическое молочко, косметические эмульсии, шампуни, жидкие
мыла, гели для душа и ванн, пены для ванн, бальзамы, дезодоранты,
депилятории, средства для и после бритья, лосьоны-тоники, лосьоны,
тоники), средства декоративной косметики (в т.ч. средства для
глаз: жидкая тушь, средства для подведения линии глаз, компактные
сухие и жидкие тени для век, губная помада, пудра, румяна
компактные и кремообразные), детская косметика и парфюмерия,
средства для ухода за волосами (шампуни, ополаскиватели, бальзамы,
маски, средства для укладки волос и др.), средства интимной
гигиены, специальная косметическая продукция (средства для загара,
фотозащитные средства и др.), косметические средства разового
использования (в ампулах, капсулах и др.), душистые воды.
Обязательному микробиологическому контролю также подлежит сырье
природного и синтетического происхождения и другие компоненты,
входящие в состав косметических средств (биологически активные
вещества - действующее начало, ингредиенты основы -
структурообразующие эмульгаторы, поверхностно-активные компоненты,
солюбилизаторы, консерванты и др.).
Не подлежат обязательному микробиологическому контролю готовые
средства, содержащие более 25% этилового спирта, окислительные
краски для волос и ногтей.
Микробиологические показатели безопасности парфюмерно-
косметической продукции в соответствии с требованиями СанПиН
1.2.631-97 "Гигиенические требования к производству и безопасности
парфюмерно-косметической продукции" (прилож. 2), приведены в табл.
1.
Таблица 1
------T----------T-----------T--------T----------T-------T-------¬
¦Груп-¦Вид косме-¦Общее коли-¦Дрожжи, ¦Бактерии ¦Staphy-¦Pseudo-¦
¦пы ¦тической ¦чество ме- ¦дрожже- ¦семейства ¦lococ- ¦monas ¦
¦ ¦продукции ¦зофильных ¦подобные¦Enterobac-¦cus ¦aerugi-¦
¦ ¦ ¦аэробных и ¦и плес- ¦teriaceae ¦aureus ¦nosa ¦
¦ ¦ ¦факульта- ¦невые ¦ ¦ ¦ ¦
¦ ¦ ¦тивно-анаэ-¦грибы ¦ ¦ ¦ ¦
¦ ¦ ¦робных бак-¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ ¦ ¦терий ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ ¦ ¦МАФАнМ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ ¦ +-----------+--------+----------+-------+ ¦
¦ ¦ ¦ КОЕ в 1 г (куб. см) продукции ¦ ¦
+-----+----------+---------------------------------------+-------+
¦I ¦Ампульная ¦ Стерильная продукция ¦
¦груп-¦косметика,¦ ¦
¦па ¦используе-¦ ¦
¦ ¦мая для ¦ ¦
¦ ¦введения ¦ ¦
¦ ¦методом ¦ ¦
¦ ¦электро- ¦ ¦
¦ ¦фореза ¦ ¦
+-----+----------+-----------T--------T----------T-------T-------+
¦II ¦Детская ¦Не более ¦Отсут- ¦Отсутствие¦Отсут- ¦Отсут- ¦
¦груп-¦косметика.¦ 2 ¦ствие ¦ ¦ствие ¦ствие ¦
¦па ¦Косметика ¦1 х 10 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ ¦для глаз ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+-----+----------+-----------+--------+----------+-------+-------+
¦III ¦Остальная ¦Не более ¦Не более¦Отсутствие¦Отсут- ¦Отсут- ¦
¦груп-¦косметика ¦ 3 ¦ 2 ¦ ¦ствие ¦ствие ¦
¦па ¦ ¦1 х 10 ¦1 х 10 ¦ ¦ ¦ ¦
L-----+----------+-----------+--------+----------+-------+--------
6. Аппаратура, растворы реактивов, питательные среды
6.1. Аппаратура
Весы лабораторные квадрантные ГОСТ 24104-88Е
4-го класса точности с наибольшим
пределом взвешивания 500 г
Весы лабораторные 2-го класса точности ГОСТ 24104-88Е
с наибольшим пределом взвешивания 200 г
рН-метр любой марки с набором электродов
с погрешностью измерений +/- 0,1 рН
Термометр 0 - 100 -С, цена деления 1 -С ГОСТ 28498-90
Автоклав (паровой стерилизатор) ГОСТ 19569-89Е
Аппарат для встряхивания
Баня водяная с терморегулятором,
позволяющая поддерживать
температуру 40 - 45 -С
Дистиллятор электрический ДЭ-4
Лупа с пятикратным увеличением ГОСТ 25706-83
Прибор для счета колоний бактерий
Прибор вакуумного фильтрования ПВФ-47
Спиртовка ГОСТ 25336-82Е
Термостаты электрические суховоздушные
с автоматическим терморегулятором до 50 -С,
позволяющие поддерживать заданную
температуру с погрешностью +/- 1 -С
6.2. Питательные среды и реактивы
Агар микробиологический ГОСТ 17206-96
Агар сухой питательный ФС 42-188ВС-90
для культивирования микроорганизмов
Агар Эндо ФС 42-186ВС-88
Бромкрезоловый пурпурный (индикатор) ГФ XI изд.
Вода дистиллированная ГОСТ 6709-72
Вода мясная ГОСТ 10444.1-84
Глюкоза ГОСТ 6038-79
Гидролизат казеина панкреатический
Глицерин ГОСТ 6824-96
Желчь сухая медицинская ОСТ 49278-75
Калий азотнокислый ГОСТ 4217-77
Калий сернокислый ГОСТ 4145-74
Калий фосфорнокислый однозамещенный ГОСТ 4198-75
Калий фосфорнокислый двузамещенный ГОСТ 2493-75
Калия теллурит, раствор массовой
концентрацией 2%
Кислота соляная, раствор массовой ГОСТ 3118-77
концентрацией (НСl) = 0,1 моль/куб. дм
Кислота сульфаниловая ГОСТ 5821-78
Кислота тиогликолевая
Кислота уксусная ледяная ГОСТ 61-75
Литий хлористый, 6-водный ГОСТ 4328-77
Магний хлористый ГОСТ 4209-77
Малахитовый зеленый, индикатор ГФ XI изд.
Маннит ГОСТ 8321-74
Мальтоза
Масло вазелиновое ГОСТ 3164-78
Масло иммерсионное ГОСТ 13739-78
Метиленовый синий
Натрия гидроокись, раствор массовой ГОСТ 4328-77
концентрацией (NaОН) = 0,1 моль/куб. дм
Натрия резазурин, раствор массовой
концентрацией 1,0 г/куб. дм
Натрий сернистокислый, раствор массовой ТУ 6-09-5313-86
концентрацией (Na SO ) = 0,1 г/куб. дм
2 3
Натрия тиогликолят
Натрий хлористый ГОСТ 4233-77
Натрий фосфорнокислый однозамещенный ГОСТ 245-76
Натрий фосфорнокислый двузамещенный ГОСТ 4172-76
N,N-диметил-п-фенилендиамин дигидрохлорид,
раствор массовой концентрацией 1%
1-Нафтиламин ГОСТ 8827-79
1-Нафтол, спиртовый раствор ГОСТ 5838-79
массовой концентрацией 1%
Основа бактериологических питательных сред ФС 42-3407-97
сухая (Бактофок-МК)
Пептон сухой ферментативный ГОСТ 13805-76
для бактериологических целей
Питательная среда N 1 (для культивирования ВФС 42-1801-88
аэробных и факультативно-анаэробных
микроорганизмов), сухая
Питательная среда N 2 (для выращивания ВФС 42-1802-88
плесневых грибов), сухая
Питательная среда N 3 (обогащения для бак- ВФС 42-1803-88
терий семейства Enterobacteriaceae), сухая
Питательная среда N 6 (для определения ВФС 42-2038-91
ферментации глюкозы)
Питательная среда N 7 (для определения ВФС 42-2020-90
реакции нитратов в нитриты), сухая
Питательная среда N 8 (для выращивания ФС 42-3181-95
Р. aeruginosa и S. aureus), сухая
Питательная среда N 9 (для выявления ВФС 42-1908-89
пигмента пиоцианина Р. aeruginosa), сухая
Питательная среда N 10 (для идентификации ВФС 42-1909-89
S. aureus), сухая
Питательная среда для контроля стерильности, ФС 42-3390-97
сухая
Плазма кролика, сухая, цитратная
для реакции плазмокоагуляции
Цистин (цистеин)
Растворы и реактивы для окраски мазков ГОСТ 10444.1-84
по Граму
Спирт этиловый ректификованный ГОСТ 5962-67
Спирт этиловый ректификованный ГОСТ 18300-87
технический
Феноловый красный, индикатор ГФ XI изд.
Экстракт дрожжевой
6.3. Материалы
Бумага индикаторная универсальная
Вата медицинская гигроскопическая ГОСТ 5556-81
Марля медицинская ОСТ 9412-93
Колбы плоскодонные конические или круглые ОСТ 25336-82
разной вместимости
Картон для предварительной фильтрации ТУ 13-7308000691-84
марки КФБЖ
Картон для предварительной фильтрации ТУ 13-7308001-673-84
марки КФМП
Пипетки разной вместимости
2 класса точности ГОСТ 20292-74
Пробирки типов П1 и П2 ГОСТ 25336-82
Штативы для пробирок
Шпатели
Чашки Петри диаметром 90 - 100 мм ГОСТ 25336-82
Цилиндры на 100 - 250 куб. см ГОСТ 1770-74
Флаконы стеклянные градуированные
вместимостью 100, 200, 500 мл ГОСТ 10782-85
Фильтры мембранные типа МФАС-Б5
или МФА-МА-N5 диаметр 47 мм,
размер пор 0,45 мкм ТУ 6-05-1903-81
Фильтры мембранные типа HAWG (Мillipore)
диаметр 47 мм, размер пор 0,45 мкм
Фильтры мембранные типа АР 15 (Мillipore)
диаметр 47 мм
Допускается применение средств измерений, вспомогательного
оборудования с аналогичными метрологическими и техническими
характеристиками, а также реактивов, материалов и питательных сред
по качеству не ниже указанных.
6.4. Приготовление растворов реактивов и питательных сред
Для приготовления растворов реактивов и питательных сред
используют дистиллированную воду, если нет специальных указаний, и
реактивы квалификации "х.ч." или "ч.д.а."
Необходимое значение рН растворов и питательных сред
устанавливают с помощью раствора гидроокиси натрия, раствор
концентрации (NаОН) = 0,1 моль/куб. дм или раствора соляной
кислоты, раствор концентрации (HCl) = 0,1 моль/куб. дм.
Значение рН растворов определяют потенциометрически при
температуре (20 +/- 2) -С.
Ориентировочное определение рН растворов и питательных сред
допускается проводить с помощью индикаторной бумаги.
6.4.1. Изотонический 0,85%-ный раствор хлористого натрия
(физиологический раствор)
0,85 г хлористого натрия растворяют в 100 куб. см
дистиллированной воды и стерилизуют при температуре (121 +/- 1) -С
в течение 15 мин.
Хранят при комнатной температуре не более 14 сут.
6.4.2. Раствор твина-80
1,0 г или 4,0 г твина-80 растворяют соответственно в 99 куб. см
или в 96 куб. см физиологического раствора, фильтруют через ватно-
марлевый фильтр и стерилизуют при температуре (121 +/- 1) -С в
течение 15 мин.
Хранят при комнатной температуре не более 14 сут.
6.4.3. Раствор фенолового красного
массовой концентрацией 1%
1,0 г фенолового красного растирают в ступке, добавляя
небольшими порциями 28,2 куб. см раствора натрия гидроокиси
массовой концентрацией 0,01 моль/куб. дм. Раствор переносят в
мерную колбу вместимостью 100 куб. см и доводят водой до метки.
Хранят во флаконе из темного стекла при температуре 4 - 10 -С.
6.4.4. Раствор малахитового зеленого
массовой концентрацией 0,5%
0,5 г малахитового зеленого помещают в стерильный флакон,
заливают 100 куб. см горячей дистиллированной воды и помещают на
сутки в термостат с температурой (37 +/- 1) -С, периодически
перемешивая.
Хранят во флаконе из темного стекла при температуре 4 - 10 -С.
6.4.5. Реактив Грисса
Раствор N 1. 0,5 г кислоты сульфаниловой растворяют в 30 куб.
см кислоты уксусной ледяной, прибавляют 100 куб. см воды,
фильтруют через бумажный фильтр.
Раствор годен в течение месяца.
Раствор N 2. 0,1 г 1-нафтиламина растворяют в 100 куб. см
кипящей воды, охлаждают, прибавляют 30 куб. см кислоты уксусной
ледяной, фильтруют через бумажный фильтр.
Раствор годен в течение 7 сут.
Перед употреблением смешивают равные объемы растворов N 1 и N
2.
6.4.6. Реактив для определения наличия фермента
цитохромоксидазы
Раствор N 1. 1,0 г 1-нафтола растворяют в 100 куб. см спирта
этилового.
Раствор N 2. 1,0 г N,N-диметил-п-фенилендиамин дигидрохлорида
растворяют в 100 куб. см дистиллированной воды.
Перед употреблением смешивают растворы N 1 и N 2 в соотношении
2:3.
Хранят во флаконах нейтрального светозащитного стекла при
температуре 4 - 10 -С в течение 14 сут.
6.4.7. Среды для культивирования аэробных
и факультативно-анаэробных бактерий
6.4.7.1. Мясо-пептонный агар с глюкозой
Пептон 10,0 г
Мясная вода 1000 куб. см
Натрия хлорид 5,0 г
Глюкоза 1,0 г
Агар микробиологический 13,0 г
Все ингредиенты растворяют в мясной воде, прибавляют замоченный
заранее агар, нагревают до полного его расплавления, устанавливают
рН = 7,3 +/- 0,1, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают
во флаконы и стерилизуют при температуре (121 +/- 1) -С в течение
15 мин.
Хранят при температуре 4 - 10 -С.
6.4.7.2. Питательный агар "МК" с глюкозой
Бактофок-МК 20,0 г
Натрия хлорид 5,0 г
Глюкоза 1,0 г
Агар микробиологический 13,0 г
Вода дистиллированная 1000 куб. см
Все ингредиенты растворяют в воде, прибавляют замоченный
заранее агар, нагревают до полного его расплавления, устанавливают
рН = 7,3 +/- 0,1, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают
во флаконы и стерилизуют при температуре (121 +/- 1) -С в течение
15 мин.
Хранят при температуре 4 - 10 -С.
Допускается использовать агар сухой питательный для
культивирования микроорганизмов или питательную среду N 1 сухую.
6.4.8. Среда для выращивания грибов (среда Сабуро)
Пептон или Бактофок-МК 10,0 г
Глюкоза или мальтоза 40,0 г
Агар микробиологический 13,0 г
Вода дистиллированная 1000 куб. см
Все ингредиенты растворяют в воде, нагревают до полного
растворения всех компонентов, устанавливают рН = 5,8 +/- 0,2,
фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают во флаконы и
стерилизуют при температуре (121 +/- 1) -С в течение 15 мин.
Хранят при температуре 4 - 10 -С.
Допускается использовать питательную среду N 2 сухую.
6.4.8.1. Среда Сабуро жидкая
Пептон или Бактофок-МК 10,0 г
Глюкоза или мальтоза 40,0 г
Вода дистиллированная 1000 куб. см
Все ингредиенты растворяют в воде, нагревают до полного
растворения всех компонентов, устанавливают рН = 5,8 +/- 0,2,
фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают во флаконы и
стерилизуют при температуре (121 +/- 1) -С в течение 15 мин.
Хранят при температуре 4 - 10 -С не более 14 сут.
6.4.9. Среды обогащения для бактерий сем. Enterobacteriaceae
6.4.9.1. Среда для выращивания бактерий
сем. Enterobacteriaceae
Пептон или Бактофок-МК 20,0 г
Глюкоза 10,0 г
Натрия фосфат двузамещенный 7,5 г
Калия фосфат однозамещенный 2,5 г
Феноловый красный 0,08 г
Малахитовый зеленый 0,015 г
Вода дистиллированная 1000 куб. см
Питательную основу и соли растворяют в дистиллированной воде
при нагревании, вносят глюкозу, прибавляют 8 куб. см 1%-ного
раствора фенолового красного и 3 куб. см 0,5%-ного малахитового
зеленого, устанавливают рН = 7,5 +/- 0,1, нагревают до полного
растворения компонентов, фильтруют через ватно-марлевый фильтр.
Стерилизуют при температуре (121 +/- 1) -С в течение 15 мин.
Хранят при температуре 4 - 10 -С не более 14 сут.
6.4.9.2. Среда Мак-Конки
Пептон или Бактофок-МК 20,0 г
Лактоза 10,0 г
Желчь сухая 5,0 г
Бромкрезоловый пурпурный 0,01 г
Вода дистиллированная 1000 куб. см
Все ингредиенты растворяют в воде, нагревают до полного
растворения компонентов, устанавливают рН = 7,5 +/- 0,1, фильтруют
через ватно-марлевый фильтр, разливают во флаконы и стерилизуют
при температуре (121 +/- 1) -С в течение 15 мин.
Хранят при температуре 4 - 10 -С не более 14 сут.
Допускается использовать питательную среду N 3 сухую.
6.4.10. Питательные среды для идентификации бактерий
сем. Enterobacteriaceae
6.4.10.1. Агар Эндо
Среду готовят, как указано на этикетке или по следующей
прописи.
К 100 куб. см питательного агара, приготовленного по п. 6.4.8,
соблюдая правила асептики, добавляют вместо глюкозы 1 г лактозы,
растворенной в 5 куб. см стерильной воды, и подогревают на кипящей
водяной бане в течение 5 мин.
В отдельную пробирку наливают 1,0 куб. см насыщенного
спиртового раствора фуксина основного, к которому добавляют
свежеприготовленный водный раствор натрия сернистокислого массовой
концентрацией 10% до обесцвечивания фуксина (бледно-розовый цвет).
Полученную смесь добавляют в расплавленный лактозный агар,
перемешивают, избегая вспенивания, и разливают в чашки Петри.
Хранят при температуре 4 - 10 -С не более 5 сут.
6.4.10.2. Среда для определения ферментации глюкозы
Пептон или Бактофок-МК 10,0 г
Глюкоза 40,0 г
Натрия хлорид 5,0 г
Феноловый красный 0,08 г
Вода дистиллированная 1000 куб. см
Питательную основу и натрия хлорид растворяют в
дистиллированной воде при нагревании, вносят глюкозу, прибавляют 8
куб. см 1%-ного раствора фенолового красного, устанавливают рН =
7,4 +/- 0,2, кипятят 1 мин., фильтруют и разливают в пробирки с
поплавками по 4 - 5 куб. см. Стерилизуют при температуре (121 +/-
1) -С в течение 15 мин. Затем как можно быстрее охлаждают среду.
Хранят при температуре 4 - 10 -С не более 14 сут.
Допускается использовать среду N 6 сухую.
6.4.10.3. Среда для определения восстановления
нитратов в нитриты
Пептон или Бактофок-МК 5,0 г
Натрия хлорид 5,0 г
Калия нитрат 1,5 г
Вода дистиллированная 1000 куб. см
Все ингредиенты растворяют в воде при нагревании, устанавливают
рН = 7,4 +/- 0,2, кипятят 1 мин., фильтруют через бумажный фильтр
и разливают в пробирки по 4 - 5 куб. см. Стерилизуют при
температуре (121 +/- 1) -С в течение 15 мин.
Хранят при температуре 4 - 10 -С не более 14 сут.
Допускается использовать питательную среду N 7 сухую.
6.4.10.4. Среда Хью-Лейфсена
Пептон или Бактофок-МК 2,0 г
Глюкоза 10,0 г
Натрия хлорид 5,0 г
Калий фосфорнокислый двузамещенный 0,3 г
Бромтимоловый синий 0,03 г
Агар микробиологический 3,0 г
Вода дистиллированная 1000 куб. см
Ингредиенты растворяют воде, добавляют заранее замоченный агар,
нагревают до полного растворения всех компонентов, кипятят 2 - 3
мин., устанавливают рН = 7,4 +/- 0,1, добавляют 3 куб. см 1%-ного
водного раствора бромтимолового синего. Среду фильтруют через
ватно-марлевый фильтр, разливают в пробирки по 10 - 15 мл и
стерилизуют при температуре (112 +/- 1) -С в течение 15 мин.
Цвет среды до автоклавирования - синий, после - травянисто-
зеленый.
Хранят при температуре 4 - 10 -С не более 14 сут.
6.4.11. Среды для выращивания Pseudomonas aeruginosa
6.4.11.1. Мясо-пептонный бульон с глюкозой
Пептон 10,0 г
Мясная вода 1000 куб. см
Натрия хлорид 5,0 г
Глюкоза 1,0 г
Все ингредиенты растворяют в мясной воде, нагревают до полного
растворения всех компонентов, устанавливают рН = 7,3 +/- 0,2,
фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают во флаконы и
стерилизуют при температуре (121 +/- 1) -С в течение 15 мин.
Хранят при температуре 4 - 10 -С.
6.4.11.2. Питательный бульон "МК" с глюкозой
Бактофок-МК 10,0 г
Натрия хлорид 5,0 г
Глюкоза 1,0 г
Вода дистиллированная 1000 куб. см
Все ингредиенты растворяют в воде, нагревают до полного
растворения компонентов, устанавливают рН = 7,3 +/- 0,2, фильтруют
через ватно-марлевый фильтр, разливают во флаконы и стерилизуют
при температуре 121 -С в течение 15 мин.
Хранят при температуре 4 - 10 -С.
6.4.11.3. Среда для выращивания Р. aeruginosa
Пептон или Бактофок-МК 10,0 г
Глюкоза 2,5 г
Натрия хлорид 5,0 г
Калий фосфорнокислый двузамещенный 2,5 г
Вода дистиллированная 1000 куб. см
Питательную основу и натрия хлорид растворяют в
дистиллированной воде при нагревании, вносят глюкозу,
устанавливают рН = 7,3 +/- 0,2, кипятят 1 мин., фильтруют через
бумажный фильтр и стерилизуют при температуре (121 +/- 1) -С в
течение 15 мин.
Хранят при температуре 4 - 10 -С не более 14 сут.
6.4.12. Среда для выявления пигмента пиоцианина
(Среда Кинг-А)
Пептон или Бактофок-МК 20,0 г
Магния хлорид безводный 5,0 г
Калия сульфат безводный 1,0 г
Глицерин 10,0 куб. см
Агар микробиологический 13,0 г
Вода дистиллированная 1000 куб. см
Все ингредиенты, кроме глицерина, растворяют в воде и оставляют
на 15 мин. Затем вносят глицерин, тщательно перемешивают,
растворяют при нагревании, устанавливают рН = 7,4 +/- 0,2, кипятят
1 мин., прибавляют замоченный заранее агар, нагревают до полного
его расплавления, фильтруют через ватно-марлевый фильтр.
Стерилизуют при температуре (121 +/- 1) -С в течение 15 мин.
Хранят при температуре 4 - 10 -С не более 14 сут.
Допускается использовать питательную среду N 9 сухую.
6.4.13. Среды для выращивания Staphylococcus aureus
6.4.13.1. Солевой бульон
В 1000 куб. см мясо-пептонного бульона или питательного бульона
"МК" вносят 65,0 г натрия хлористого, перемешивают до полного
растворения соли, разливают во флаконы и стерилизуют при
температуре (121 +/- 1) -С в течение 15 мин.
Хранят при температуре 4 - 10 -С не более 14 сут.
6.4.13.2. Среда по п. 6.4.11.3.
6.4.14. Среды для идентификации Staphylococcus aureus
6.4.14.1. Желточно-солевой агар
Эмульсия яично-желточная: куриное яйцо протирают ватой,
смоченной этиловым спиртом, помещают в стерильную чашку Петри,
стерильным инструментом пробивают с противоположных сторон яйца
два отверстия. Через одно отверстие полностью удаляют белок,
затем, увеличив отверстие, выливают желток в стерильную колбу с 50
куб. см физиологического раствора, содержимое встряхивают до
получения однородной массы.
Хранят при температуре 4 - 10 -С.
В 100 куб. см одной из питательных сред, приготовленных по п.
6.1.8, расплавленной до 45 - 50 -С, вносят 9,5 г натрия хлористого
и 10 куб. см яично-желточной эмульсии. Смесь перемешивают до
полной гомогенизации компонентов и разливают в чашки Петри.
Хранят при температуре 4 - 10 -С не более 5 сут.
6.4.14.2. Агар Байрд-Паркер
Основа среды. В 1000 куб. см одной из питательных сред,
приготовленных по п. п. 6.4.11.1 или 6.4.11.2, вносят 17,9 г лития
хлористого, 15 г агара микробиологического, 5,0 г экстракта
дрожжевого, перемешивают и нагревают до полного растворения
компонентов. Охлаждают до 50 - 60 -С, устанавливают рН = 6,9 +/-
0,1, разливают во флаконы по 100 куб. см и стерилизуют при
температуре (121 +/- 1) -С в течение 15 мин.
Хранят при температуре 4 - 10 -С не более 14 сут.
Перед употреблением к 100 куб. см расплавленной и охлажденной
до 45 - 50 -С основы среды прибавляют 0,5 куб. см 2%-ного раствора
калия теллурита и 5 куб. см яично-желточной эмульсии,
приготовленной как указано выше. Среду перемешивают до полной
гомогенизации компонентов и разливают в чашки Петри. Перед посевом
чашки подсушивают в термостате.
Хранят при температуре 4 - 10 -С не более 48 ч.
6.4.14.3. Маннитно-солевой агар
Пептон или Бактофок-МК 10,0 г
Натрия хлорид 75,0 г
Маннит 10,0 г
Феноловый красный 0,025 г
Агар микробиологический 13,0 г
Вода дистиллированная 1000 куб. см
Все компоненты растворяют в воде, вносят 2,5 куб. см 1%-ного
раствора фенолового красного, устанавливают рН = 7,6 +/- 0,2,
кипятят 1 мин., прибавляют замоченный заранее агар, нагревают до
полного расплавления, фильтруют через ватно-марлевый фильтр.
Стерилизуют под давлением при температуре (121 +/- 1) -С в течение
15 мин.
Хранят при температуре 4 - 10 -С не более 14 сут.
Допускается использовать питательную среду N 10 сухую.
6.4.14.4. Среда Гисса с маннитом или мальтозой
Пептон или Бактофок-МК 10,0 г
Натрия хлорид 5,0 г
Маннит или мальтоза 10,0 г
Феноловый красный 0,025 г
Агар микробиологический 13,0 г
Вода дистиллированная 1000 куб. см
Все компоненты растворяют в воде, вносят 2,5 куб. см 1%-ного
раствора фенолового красного, устанавливают рН = 7,6 +/- 0,2,
кипятят 1 мин., прибавляют замоченный заранее агар, нагревают до
полного расплавления, фильтруют через ватно-марлевый фильтр.
Стерилизуют под давлением при температуре (121 +/- 1) -С в течение
15 мин.
Хранят при температуре 4 - 10 -С не более 14 сут.
6.4.15. Среда для контроля стерильности
(тиогликолевая среда)
Среду готовят в соответствии с указаниями на этикетке или по
следующей прописи:
Панкреатический гидролизат казеина 15,0 г
Дрожжевой экстракт 5,0 г
Натрия хлорид 2,5 г
Глюкоза 5,0 г
Цистин (цистеин) 0,75 г
Тиогликолевая кислота или 0,5 г
тиогликолят натрия
Раствор резазурина натрия (1:1000) 1,0 куб. см
Агар микробиологический 0,75 г
Вода дистиллированная 1000 куб. см
Все ингредиенты растворяют в воде, прибавляют замоченный
заранее агар, нагревают до полного растворения всех компонентов,
устанавливают рН = 7,2 +/- 0,2, фильтруют через ватно-марлевый
фильтр, разливают во флаконы и стерилизуют при температуре (121 +/-
1) -С в течение 15 мин.
Хранят при температуре 10 - 25 -С в защищенном от света месте в
течение 14 сут.
6.4.16. Буферный раствор
1,0 г пептона ферментативного (или Бактофок-МК), 4,3 г
хлористого натрия, 7,23 г фосфорнокислого двузамещенного натрия и
3,56 г фосфорнокислого однозамещенного калия растворяют при
нагревании в 1000 куб. см дистиллированной воды, фильтруют через
бумажный фильтр, устанавливают рН = 7,0 и разливают в стеклянные
флаконы по 400 куб. см, стерилизуют 15 мин. при температуре (121
+/- 1) -С.
Хранят при температуре 4 - 6 -С не более 14 сут.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. СП 1.2.731-99 "Безопасность работы с микроорганизмами III -
IV групп патогенности и гельминтами".
2. СанПиН 1.2.631-97 "Гигиенические требования к производству и
безопасности парфюмерно-косметической продукции".
3. ГОСТ 26670-91 "Продукты пищевые. Методы культивирования
микроорганизмов".
4. ГОСТ 10444.15-94 "Продукты пищевые. Методы определения
количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных
микроорганизмов".
5. ГОСТ 10444.2-94 "Продукты пищевые. Методы выявления и
определения количества Staphylococcus aureus".
6. ГОСТ 26668-85 "Продукты пищевые. Методы отбора проб для
микробиологических анализов".
7. ГОСТ 26972-86 "Зерно, крупа, мука, толокно для продуктов
детского питания. Методы микробиологического анализа".
8. ГОСТ 10444.1-84 "Консервы. Приготовление растворов
реактивов, красок, индикаторов и питательных сред, применяемых в
микробиологическом анализе".
9. "Методические указания по микробиологической диагностике
заболеваний, вызываемых энтеробактериями", МЗ СССР N 04-723/3 от
17.12.84.
10. Методические указания МУК 4.2.590-96 "Бактериологические
исследования с использованием экспресс-анализатора "Бак Трак
4100". Утв. 18.11.96 Государственным комитетом санитарно-
эпидемиологического надзора.
11. Государственная Фармакопея XI изд.
12. Определитель бактерий Берджи /Под ред. Дж. Хоулта, Н.
Крига, П. Снита, Дж. Стенли, С. Уилльямса. - М.: Мир, 1997.
|