Утверждаю
Руководитель
Департамента ветеринарии
Минсельхозпрода России
В.М.АВИЛОВ
4 октября 1999 г. N 13-4-2/1751
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ГЕЛЬМИНТОЗООНОЗОВ
В ПРЕСНОВОДНЫХ РЫБАХ
1. Общие положения
1.1. Гельминтозоонозы - группа паразитарных болезней,
возбудители которых в личиночной стадии обнаруживаются у различных
видов рыб, а в половозрелой - у человека и животных.
1.2. Возбудители гельминтозоонозов проходят сложный цикл
развития с участием промежуточных (моллюски, циклопы, диаптомусы и
олигохеты), дополнительных (пресноводные рыбы) и окончательных
(человек, кошка, собака, дикий кабан, волк, лисица, выдра и др.)
хозяев.
1.3. Личиночные стадии возбудителей гельминтозоонозов по
отношению к дополнительным хозяевам имеют определенную
приуроченность и характерные места локализации (Приложение 1).
2. Исследование рыб
2.1. Для исследования отбирают 10 - 15 экземпляров живых или
свежеуснувших рыб обследуемого вида, регистрируют с указанием даты
исследования, вида рыб и места вылова.
2.2. Рыб взвешивают, измеряют длину от вершины рыла до начала
лучей хвостового плавника. Осматривают плавники, чешую, жабры.
Участки с изменениями просматривают под лупой и микроскопом
(увеличение 2 х 8). Ножницами разрезают брюшко по средней линии от
анального отверстия до области сердца. С помощью лупы
просматривают сердце, гонады, печень, селезенку, почки, стенки
желудка, кишечник, серозные покровы. Каждый орган отдельно
помещают в чашки Петри или на часовые стекла. Из органов и тканей
нарезают полоски длиной до 10 мм и толщиной 3 - 4 мм, помещают в
компрессориум или между стеклами 9 х 12 см и микроскопируют. Мышцы
осматривают, разрезая на продольные и поперечные полоски, и
исследуют под микроскопом.
2.3. В мускулатуре рыб встречаются метацеркарии трематод,
патогенные и непатогенные для человека и животных. Последних в
половозрелой стадии обнаруживают в кишечнике рыбоядных птиц
(чайки, цапли) и хищных рыб (щука). Для дифференциации этих
личинок гельминтов у рыб пользуются таблицей (Приложение 2).
2.4. Для патогенных человеку и животным метацеркарий трематод
из сем. Opisthorchidae (описторхисы, меторхисы, псевдамфистомы,
клонорхисы) при осмотре под микроскопом характерно наличие двух
круглых одинакового размера присосок, которые окрашены светлее
тела личинки, и черного экскреторного пузыря овальной или
грушевидной формы, занимающего 1/3 - 1/4 тела личинки (рис. 1 - 2
- не приводятся). Для живых личинок характерно активное движение в
цисте.
2.5. Из непатогенных для человека и животных метацеркарий
трематод близкое строение к описторхидам имеют личинки из рода
буцефал и рипидокотил, для которых характерно наличие одной
крупной ротовой присоски чашеобразной формы с пальцеобразными
выступами, экскреторного пузыря зигзагообразной формы, занимающего
2/3 тела личинки (рис. 3 - не приводится), и слабой подвижности
живых личинок в цисте.
2.6. Для метацеркарий параценогонимусов характерна большая
черная экскреторная система с 3 белыми щелевидными пространствами
(рис. 4 - не приводится). Другие личинки, встречающиеся у рыб,
определяют, пользуясь табл. 2.
3. Определение жизнеспособности личинок
3.1. Извлеченных из органов и тканей рыбы (из цисты)
плероцеркоидов помещают в подогретый (до 40 -С) физиологический
раствор или в искусственный желудочный сок (100 мл 0,5%-ного
раствора поваренной соли, 0,5 г пепсина, 0,75 мл 35%-ного раствора
соляной кислоты). Под лупой осторожно раздражают личинку
препаровальной иглой. Наличие даже слабых движений указывает на
жизнеспособность плероцеркоида.
3.2. Личинки из органов рыб освобождают от остатков ткани под
контролем лупы. На препарат наносят 2 капли 3%-ного раствора
розоловой кислоты на 70%-ном спирте на 2 минуты, добавляют каплю
0,1%-ного раствора едкого калия, оставляют на 2 минуты. Излишек
краски смывают физиологическим раствором, препарат высушивают
полоской фильтровальной бумаги, накрывают покровным стеклом и
просматривают под микроскопом. Мышечная ткань и мертвые личинки
окрашиваются в розовый цвет, живые личинки не окрашиваются.
3.3. Жизнеспособность личинок трематод можно определять,
используя микроскоп с подогревательным столиком. Выделенных
паразитов переносят на столик (при 36 - 37 -С), добавляют 2 - 3
капли желчи или 0,5%-ного раствора трипсина. Живые личинки через 5
- 10 минут выходят из цист.
3.4. Цисту, извлеченную из ткани рыб, под микроскопом в капле
физиологического раствора препаровальными иглами освобождают от
наружной оболочки. При легком надавливании иглой на покровное
стекло, под которое помещают препарат, внутренняя оболочка
разрывается. Наличие движений у личинки указывает на ее
жизнеспособность.
4. Определение видовой принадлежности личинок
4.1. В сомнительных случаях, если не удается сразу установить
вид метацеркарий трематод, обнаруженных в пробе, рекомендуется
произвести освобождение личинок от оболочек механически (п. 3.4)
или химическим способом (п. 3.2 и п. 3.3).
4.2. Измельченные кусочки поверхностного слоя спинных мышц (0,3
х 0,5 см) в количестве 10 - 15 г помещают в искусственный
желудочный сок в соотношении 1:10. Выдерживают в термостате при 37
- 40 -С 2 - 3 часа, процеживают через марлю. Осадок переносят в
чашку Петри, цисты вылавливают пипеткой при проходящем свете под
лупой или под микроскопом или, добавив физиологический раствор,
круговыми движениями чашки отмывают, при этом цисты
концентрируются в центре чашки. Раствор с края осторожно удаляют
резиновой грушей. Промывку повторяют до полного удаления остатков
непереваренной мышечной ткани. Для освобождения от внутренней
оболочки цисты помещают в теплый (22 - 24 -С) раствор трипсина и
поваренной соли (на 100 мл 1%-ного раствора поваренной соли берут
1 г трипсина).
4.3. Личинки гельминтов, освобожденные от оболочек, имеют
характерные признаки, по которым их можно отнести к определенному
виду. Определяют видовую принадлежность личинок, используя
Приложение 2.
4.4. Видовую принадлежность личинок гельминтов определяют
также, используя биологическую пробу. Для этого подопытным
животным (предпочтительно - котятам, в крайнем случае - щенкам,
морским свинкам, хомякам) скармливают мясо рыб с личинками
гельминтов или мелкую инвазированную рыбу. Определение вида
паразита проводят через 3 - 4 недели после начала опыта по
обнаруженным в фекалиях животных яйцам или по половозрелым
гельминтам в печени, желчном пузыре, кишечнике (в зависимости от
вида гельминта) при вскрытии подопытных животных.
5. Меры профилактики
5.1. При работе с патологическим материалом необходимо
соблюдать меры личной профилактики. По окончании исследования
следует тщательно мыть руки с мылом и щеткой, а место работы
обрабатывают 2%-ным раствором кальцинированной соды.
5.2. Выловленная из водоема рыба, где обнаружены возбудители
гельминтозоонозов, считается условно годной и подлежит переработке
в соответствии с Инструкцией по санитарно-гельминтологической
оценке рыбы, зараженной личинками дифиллоботриид (возбудителями
дифиллоботриозов) и личинками описторхисов (возбудителями
описторхоза), и ее технологической обработке.
***
С утверждением настоящих Методических указаний утрачивает силу
"Методика определения возбудителей гельминтозоонозов в
пресноводных рыбах", утв. ГУВ МСХ СССР 21.03.83 N 115-6а.
Приложение N 1
к Методическим указаниям
по определению возбудителей
гельминтозоонозов в пресноводных рыбах,
утв. 4 октября 1999 года
ПОРАЖАЕМЫЕ ВИДЫ РЫБ И МЕСТА ЛОКАЛИЗАЦИИ ЛИЧИНОК -
ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ГЕЛЬМИНТОЗООНОЗОВ
------------------T------------------------T---------------------¬
¦ Вид паразита ¦ Поражаемые виды рыб ¦ Наиболее частая ¦
¦ ¦ ¦ локализация личинок ¦
+-----------------+------------------------+---------------------+
¦Opisthorchis ¦В наибольшей степени ¦Поверхностный слой ¦
¦felineus, ¦язь, елец, линь, меньше ¦мышц на глубине 2 - ¦
¦Metorchis ¦- плотва, усач, лещ, ¦3,4 см (в небольшом ¦
¦albidus, ¦густера, жерех, пескарь,¦количестве обнаружи- ¦
¦Pseudamphistomum ¦сазан, красноперка, ¦ваются во внутренних ¦
¦truncatum ¦уклея, сырть, подуст, ¦органах, жабрах, ¦
¦ ¦гольян, вобла, овсянка ¦стенках кишечника, ¦
¦ ¦и др. ¦на чешуе) ¦
+-----------------+------------------------+---------------------+
¦Clonorchis ¦Сазан, черный и белый ¦То же ¦
¦sinensis ¦амур, толстолобик, ¦ ¦
¦ ¦верхогляд, карась, ¦ ¦
¦ ¦окуневые, бычковые и др.¦ ¦
+-----------------+------------------------+---------------------+
¦Metagonimus ¦Преимущественно карповые¦Плавники, поверхность¦
¦yokogawai ¦ ¦кожи ¦
+-----------------+------------------------+---------------------+
¦Diphyllobotrium ¦Щука, окунь, ерш, налим ¦Икра, молоки, печень,¦
¦latum ¦ ¦серозные покровы, ¦
¦ ¦ ¦мышцы (без цист) ¦
+-----------------+------------------------+---------------------+
¦D.dendriticum ¦Хариус, омуль, сиг, ¦Мышечная ткань, ¦
¦ ¦корюшка, окунь, ряпушка,¦молоки, икра, печень,¦
¦ ¦голец, муксун, форель ¦серозные покровы ¦
¦ ¦ ¦(инцистируются) ¦
+-----------------+------------------------+---------------------+
¦Nanophyetes ¦Ленок, таймень, амурский¦Мышцы плавников, ¦
¦schikchobalowi ¦сиг, кета, горбуша, ¦сердце, почки, ¦
¦ ¦амурский хариус ¦реже - мышцы тела, ¦
¦ ¦ ¦головы, жабры ¦
+-----------------+------------------------+---------------------+
¦Rossicotrema ¦Окунь, ерш, судак ¦Плавники, поверхность¦
¦donicum ¦ ¦кожи ¦
+-----------------+------------------------+---------------------+
¦Echinochasmus ¦Щука, линь, сазан, лещ, ¦Жаберные лепестки ¦
¦perfoliatus ¦язь, густера, вобла, ¦ ¦
¦ ¦красноперка, плотва, ¦ ¦
¦ ¦тарань, жерех, бело- ¦ ¦
¦ ¦глазка, синец, карась, ¦ ¦
¦ ¦уклея, окунь, судак, ¦ ¦
¦ ¦ерш, вьюн, сом, карп ¦ ¦
+-----------------+------------------------+---------------------+
¦Dioctophyme ¦Язь, плотва, щука, ¦Стенки кишечника, ¦
¦renale ¦шемая, лопатонос, усач, ¦мышечная ткань (в ¦
¦ ¦сом ¦виде цист) ¦
L-----------------+------------------------+----------------------
Приложение N 2
к Методическим указаниям
по определению возбудителей
гельминтозоонозов в пресноводных рыбах,
утв. 4 октября 1999 года
ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ТАБЛИЦА ЛИЧИНОК ГЕЛЬМИНТОВ,
ОБНАРУЖИВАЕМЫХ У ПРЕСНОВОДНЫХ РЫБ
--------------T-------------T--------------T-------------T-------------T-------------T-------------¬
¦Вид паразита ¦Размер (мм), ¦Оболочки цист,¦Форма, размер¦ Количество, ¦ Подвижность ¦ Описание ¦
¦ ¦ форма цист ¦ цвет, ¦экскреторного¦ форма и ¦живой личинки¦ личинки, ¦
¦ ¦ личинок ¦ расположение ¦ пузыря ¦ величина ¦ ¦освобожденной¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦присосок (РП ¦ ¦ от оболочек ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ - ротовая, ¦ ¦(размер в мм)¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦БП - брюшная ¦ ¦ ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ присоски) ¦ ¦ ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦(размер в мм)¦ ¦ ¦
+-------------+-------------+--------------+-------------+-------------+-------------+-------------+
¦ 1 ¦ 2 ¦ 3 ¦ 4 ¦ 5 ¦ 6 ¦ 7 ¦
+-------------+-------------+--------------+-------------+-------------+-------------+-------------+
¦ Метацеркарии трематод, патогенных для теплокровных ¦
+-------------T-------------T--------------T-------------T-------------T-------------T-------------+
¦Opisthorchis ¦0,28 - 0,38 х¦Наружная ¦Черный, ¦Присоски ¦Движения ¦Тело личинки ¦
¦felineus ¦0,18 - 0,28 ¦равномерно ¦округлый, ¦круглые, ¦энергичные ¦покрыто ¦
¦ ¦овальная, ¦прилегает к ¦почковидный, ¦РП - 0,088; ¦ ¦шипиками до ¦
¦ ¦реже круглая ¦внутренней ¦занимает не ¦БП - 0,077 ¦ ¦уровня БП, ¦
¦ ¦ ¦ ¦более 1/3 ¦ ¦ ¦задний конец ¦
¦ ¦ ¦ ¦тела личинки ¦ ¦ ¦веретенооб. ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦формы, ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦0,47 - 0,50, ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦0,12 - 0,14 ¦
+-------------+-------------+--------------+-------------+-------------+-------------+-------------+
¦Pseudamphis- ¦0,21 - 0,38 х¦То же ¦То же ¦Круглые, ¦Движения ¦0,6 - 0,9; ¦
¦tomum ¦0,14 - 0,24 ¦ ¦ ¦одинакового ¦замедленные ¦0,15 - 0,20, ¦
¦truncatum ¦ ¦ ¦ ¦размера ¦ ¦задний конец ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦обрублен, все¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦тело личинки ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦покрыто ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦шипиками ¦
+-------------+-------------+--------------+-------------+-------------+-------------+-------------+
¦Metorchis ¦0,32 - 0,46, ¦Тонкие, рядом,¦Черный ¦РП и БП ¦То же ¦0,6 - 0,9; ¦
¦albidus ¦0,26 - 0,40 ¦без утолщений ¦округлый, ¦одинакового ¦ ¦0,16 - 0,20, ¦
¦ ¦без капсулы -¦ ¦овальный; ¦размера ¦ ¦задний конец ¦
¦ ¦0,30 - 0,44 х¦ ¦занимает 1/3 ¦0,08 х 0,01 ¦ ¦в нижней ¦
¦ ¦0,24 - 0,38 ¦ ¦тела личинки ¦ ¦ ¦трети тела ¦
¦ ¦круглые ¦ ¦ ¦ ¦ ¦расширен ¦
+-------------+-------------+--------------+-------------+-------------+-------------+-------------+
¦Clonorchis ¦0,150 - 0,180¦Равномерно ¦Черный ¦РП - 0,54 - ¦Слабые ¦0,375 - 0,315¦
¦sinensis ¦х 0,150 - ¦прилегают друг¦грушевидный, ¦0,56 х 0,51 -¦движения ¦х 0,125 - ¦
¦ ¦0,165, ¦к другу ¦занимает 1/4 ¦0,60, БП - ¦ ¦0,150 ¦
¦ ¦круглая, ¦ ¦тела; гранулы¦0,66 - 0,75 х¦ ¦ ¦
¦ ¦овальная ¦ ¦10 мкм плотно¦0,63 - 0,72 ¦ ¦ ¦
¦ ¦ ¦ ¦расположены ¦ ¦ ¦ ¦
+-------------+-------------+--------------+-------------+-------------+-------------+-------------+
¦Metagonimus ¦0,157 - ¦Толщина ¦У-образный, ¦БП меньше РП ¦Движения ¦Шипы, покры- ¦
¦yokogawai ¦0,157, ¦наружной ¦экскр. грану-¦и смещена в ¦активные ¦вающие тело, ¦
¦ ¦округлая ¦оболочки ¦лы мелкие, ¦сторону ¦ ¦чешуевидной ¦
¦ ¦ ¦отличается от ¦расположены ¦ ¦ ¦формы ¦
¦ ¦ ¦внутренней ¦не плотно ¦ ¦ ¦ ¦
+-------------+-------------+--------------+-------------+-------------+-------------+-------------+
¦Echinochasmus¦0,080 - 0,110¦Наружная ¦Из двух ¦БП выступает,¦Движения ¦0,1161 - ¦
¦perfoliatus ¦х 0,079 - ¦оболочка цисты¦экскреторных ¦лежит в зад- ¦слабые ¦0,043, ¦
¦ ¦0,098, ¦прозрачная, ¦полостей ¦ней трети те-¦ ¦ротовая при- ¦
¦ ¦овальные, ¦эластичная ¦ ¦ла; головной ¦ ¦соска имеет ¦
¦ ¦круглые ¦ ¦ ¦воротник не- ¦ ¦головной во- ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦сет 24 шипика¦ ¦ротник с 24 ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦шипиками ¦
+-------------+-------------+--------------+-------------+-------------+-------------+-------------+
¦Плероцеркои- ¦10 - 60 х 1 -¦Тело булаво- ¦- ¦На головном ¦Активно дви- ¦ ¦
¦ды цестод ¦3 мм, белова-¦видное с попе-¦ ¦конце щеле- ¦жутся в физ. ¦ ¦
¦Diphyllobot- ¦то-молочные; ¦речными морщи-¦ ¦видное обра- ¦растворе при ¦ ¦
¦rium latum ¦не инцистиру-¦нами ¦ ¦зование ¦28 - 30 -С ¦ ¦
¦ ¦ются ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+-------------+-------------+--------------+-------------+-------------+-------------+-------------+
¦Diphyllobot- ¦Чаще инцисти-¦Тело сигарооб-¦- ¦На головном ¦Подвижны при ¦ ¦
¦rium ¦руются, ¦разное, со ¦ ¦конце сильно ¦освобождении ¦ ¦
¦dendriticum ¦длина личинки¦значительной ¦ ¦выражена при-¦из цист ¦ ¦
¦ ¦вне цисты ¦морщинисто- ¦ ¦сасывательная¦ ¦ ¦
¦ ¦7 - 45 мм ¦стью. Передний¦ ¦бороздка ¦ ¦ ¦
¦ ¦и больше ¦отдел более ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ ¦ ¦заострен ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+-------------+-------------+--------------+-------------+-------------+-------------+-------------+
¦ Метацеркарии трематод, непатогенных для теплокровных ¦
+-------------T-------------T--------------T-------------T-------------T-------------T-------------+
¦Paracoenogo- ¦0,42 - 0,50, ¦Наружная ¦В виде трой- ¦Две и орган ¦Мало подвижна¦Яйцевидной ¦
¦nimus ovatus ¦с наружней ¦оболочка в 2 -¦ника в конце ¦Брандеса ¦ ¦формы ¦
¦ ¦капсулой до ¦4 раза толще ¦со щелевидны-¦0,08 - 0,12, ¦ ¦ ¦
¦ ¦0,70; ¦внутр. ¦ми простран- ¦РП - 0,04 - ¦ ¦ ¦
¦ ¦сферичн., ¦(равномерно ¦ствами, зани-¦0,07; БП - ¦ ¦ ¦
¦ ¦темн., ¦отстает) ¦мает все тело¦0,02 - 0,04 ¦ ¦ ¦
¦ ¦прозрачн. ¦ ¦личинки ¦ ¦ ¦ ¦
+-------------+-------------+--------------+-------------+-------------+-------------+-------------+
¦Bucephalus ¦0,27 - 0,36 х¦Тонкие, ¦Зигзагообраз-¦РП - 0,18 - ¦Движение ¦0,6 - 2,3 х ¦
¦polymorphus ¦0,43, про- ¦неравномерно ¦ная, занимает¦0,22, ¦активное у ¦0,35, на РП 7¦
¦ ¦зрачные, ова-¦отстают друг ¦2/3 тела ¦имеет ¦освобожденной¦пальцевидных ¦
¦ ¦льные (0,20 -¦от друга ¦личинки ¦пальцевидные ¦личинки ¦выростов ¦
¦ ¦0,34 х 0,38 -¦ ¦ ¦мускульные ¦ ¦ ¦
¦ ¦0,43) ¦ ¦ ¦отростки ¦ ¦ ¦
+-------------+-------------+--------------+-------------+-------------+-------------+-------------+
¦Rhipidocotyle¦Прозрачн., ¦То же ¦То же ¦РП - 0,18 - ¦Движения ¦0,8 - 1,0, ¦
¦illense ¦сферическ., ¦ ¦ ¦0,23 х 0,15 -¦замедленные, ¦0,8 х 0,16 - ¦
¦ ¦овальн., ¦ ¦ ¦0,22, имеет ¦у основания ¦0,28, РП име-¦
¦ ¦0,27 - 0,37 х¦ ¦ ¦2 ушкообразн.¦личинки ¦ет 2 ушкооб- ¦
¦ ¦0,27 - 0,37 ¦ ¦ ¦выроста ¦активные ¦разных ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦выроста ¦
+-------------+-------------+--------------+-------------+-------------+-------------+-------------+
¦Posthodiplos-¦0,6 - 0,9 мм,¦Вокруг ¦Из-за черного¦РП меньше БП ¦Движения ¦0,15 - 1,5 ¦
¦tomum ¦чечевицеоб- ¦наружной ¦пигмента не ¦ ¦незаметные ¦ ¦
¦cuticola ¦разн., с ¦оболочки ¦просматрива- ¦ ¦ ¦ ¦
¦ ¦черным ¦откладывается ¦ется ¦ ¦ ¦ ¦
¦ ¦пигментом ¦черный пигмент¦ ¦ ¦ ¦ ¦
L-------------+-------------+--------------+-------------+-------------+-------------+--------------
Примечание: у рыб могут обнаруживаться также цисты
миксоспоридий различных форм и размеров (от 0,04 до 1,00 мм). Эти
цисты имеют специфические детали внутреннего строения, отличные от
таковых личинок гельминтов.
Приложение N 3
к Методике определения
возбудителей гельминтозоонозов
в пресноводных рыбах
МЕТАЦЕРКАРИИ ТРЕМАТОД, ПАТОГЕННЫЕ (РИС. 1, 2)
И НЕПАТОГЕННЫЕ (РИС. 3, 4) ДЛЯ ТЕПЛОКРОВНЫХ
1 - личинка вне цисты;
2 - личинка в цисте;
3 - личинка в мускулатуре;
4 - яйцо.
Рис. 1. Opisthorchis felineus
Рисунок не приводится.
1 - личинка в цисте;
2 - личинка вне цисты;
3 - яйцо.
Рис. 2. Pseudamphistomum truncatum
Рисунок не приводится.
1 - личинка, извлеченная из цисты;
2 - личинка в цисте.
Рис. 3. Bucephalus polymorphus
Рисунок не приводится.
а) личинка в оболочке;
б) личинка без оболочки.
Рис. 4. Paracoenogonimus ovatus
Рисунок не приводится.
|
