Утверждаю
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации,
Первый заместитель
Министра здравоохранения
Российской Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
20 сентября 2001 года
Дата введения:
с момента утверждения
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
МЕТОД МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ИЗМЕРЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ
КЛЕТОК МИКРООРГАНИЗМА STREPTOMYCES CINNAMONENSIS
НИЦБ 109 - ПРОДУЦЕНТА МОНЕНЗИНА В ВОЗДУХЕ РАБОЧЕЙ ЗОНЫ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
МУК 4.2.1067-01
1. Разработаны к.б.н. Бару Р.В., к.б.н. Лапчинской А.В.
(Государственный научный центр по антибиотикам).
2. Утверждены и введены в действие Главным государственным
санитарным врачом Российской Федерации - Первым заместителем
Министра здравоохранения Российской Федерации 20 сентября 2001 г.
3. Введены впервые.
1. Общие положения и область применения
Настоящие методические указания устанавливают методику
проведения микробиологического количественного анализа
концентрации клеток штамма Streptomyces cinnamonensis НИЦБ 109 -
продуцента монензина в воздухе рабочей зоны в диапазоне
концентраций от 100 до 3000 клеток в 1 куб. м воздуха.
Методические указания разработаны в соответствии с
требованиями ГОСТ 12.1.005-88 "ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие
санитарно-гигиенические требования" и ГОСТ Р 8.563-96 "Методики
выполнения измерений".
Методические указания предназначены для применения в
лабораториях предприятий, организаций и учреждений,
аккредитованных в установленном порядке на право проведения
микробиологических исследований.
2. Характеристика штамма-продуцента монензина
Микроорганизм Streptomyces cinnamonensis НИЦБ 109 является
продуцентом антибиотика монензина. Штамм растет на различных
агаризованных и жидких средах. Культура образует цепочки спор,
обычно прямые или слегка извилистые, с гладкой оболочкой.
На твердой питательной среде ISP на 3 сутки роста при
температуре 28 -С образует округлые радиально-складчатые
морщинистые колонии с кремовым или сероватым налетом, фестончатым
краем и выпуклым более темным центром диаметром 1 - 2 мм. На
шестые сутки инкубации размеры колонии достигают 3 - 5 мм,
конфигурация и складчатость колоний не изменяется, образуется
воздушный мицелий со спорами бежевато-серого цвета, в среду
выделяет коричневый пигмент. Штамм устойчив к следующим
антибиотикам: левомицетину (30 мкг/мл), линкомицину (15 мкг/мл),
полимиксину М (100 мкг/мл), эритромицину (мкг/мл), тетрациклину
(30 мкг/мл) и олеандомицину (15 мкг/мл). ПДК - 3000
р.з.
кл./куб. м.
3. Пределы измерений
Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток
продуцента монензина в воздухе рабочей зоны в диапазоне
концентраций от 100 до 5000 клеток в 1 куб. м воздуха при
доверительной вероятности 0,95.
4. Метод измерений
Метод основан на аспирации из воздуха клеток продуцента
монензина на поверхность плотной питательной среды и подсчете
выросших колоний по типичным морфологическим признакам.
5. Средства измерений, вспомогательные устройства,
реактивы и материалы
При выполнении измерений применяют следующие средства
измерений, вспомогательные устройства и материалы.
5.1. Средства измерений,
вспомогательные устройства, материалы
Прибор для бактериологического анализа
воздуха, модель 818 (щелевой прибор Кротова) ТУ 64-12791 77
Термостаты электрические суховоздушные или
водяные
Автоклав электрический ГОСТ 9586-75
Бокс, оборудованный бактерицидными лампами
Холодильник бытовой
Весы лабораторные аналитические типа ВЛА-200
Микроскоп биологический с иммерсионной
системой типа "Биолам" Л-211
Лупа с увеличением х10 ГОСТ 25706-83
Чашки Петри бактериологические плоскодонные
стеклянные диаметром 100 мм
Пробирки биологические вместимостью 20 и 35 мл ГОСТ 10515-75
Пипетки мерные на 1,5 и 10 мл ГОСТ 10515-75
Пипетки мерные на 1,5, и 10 мл ГОСТ 1770-74
Колбы конические вместимостью 250 и 500 мл ГОСТ 1770-74
Секундомер ГОСТ 9586-75
Барометр ГОСТ 24696-79
Марля медицинская ГОСТ 9412-77
Вата медицинская гигроскопическая ГОСТ 25556-81.
5.2. Реактивы, растворы
Антибиотики: левомицетин, линкомицин,
полимиксин М, эритромицин, тетрациклин,
олеандомицин и нистатин
Спирт этиловый ректификат ГОСТ 5962-67
Селективная среда для штамма-продуцента
Среда ISP: Мальт-экстракт (Difco) - 1,5%,
дрожжевой экстракт (Difco) - 0,5%, крахмал
растворимый - 0,5%, мел химический осажденный
- 0,3%, Бакто-агар (Difco) - 2,0%, вода
дистиллированная - 100 мл, рН 7,2 - 7,4.
6. Требования безопасности
При выполнении измерений концентрации клеток продуцента
монензина в воздухе рабочей зоны соблюдают:
- правила техники безопасности при работе с химическими
реактивами по ГОСТ 12.1.005-88;
- правила электробезопасности при работе с электроустановками
по ГОСТ 12.1.019-79 и инструкцию по эксплуатации прибора;
- положения "Инструкций по устройству, требованиям
безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических
лабораториях предприятий микробиологической промышленности"
(1977).
Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу
при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом
осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.
7. Требования к квалификации операторов
К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются
лица с высшим или средним специальным образованием, прошедшие
соответствующую подготовку и имеющие навыки работы в области
микробиологических исследований.
8. Условия измерений
Процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу
проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20 +/- 5)
-С, атмосферном давлении 630 - 800 мм рт. ст. и влажности воздуха
не более 80%.
9. Проведение измерений
9.1. Условия отбора проб воздуха
Для определения продуцента монензина воздух аспирируют при
помощи аппарата Кротова со скоростью 10 л/мин. на поверхность
плотной питательной среды. Время аспирации воздуха (1 - 10 мин.)
зависит от предполагаемой концентрации клеток продуцента.
Аппарат Кротова перед каждым отбором пробы воздуха тщательно
протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность
подвижного диска и внутреннюю стенку прибора, наружную и
внутреннюю стенку крышки. На подвижный диск устанавливают
подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее
крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой
недопустимо. После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор
открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от
данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку
контроля, время аспирации и дату отбора пробы.
9.2. Выполнение анализа
Метод предполагает учет количества типичных по морфологическим
признакам колоний, выросших на 3 - 6-е сутки после посева воздуха.
Прямой метод позволяет учитывать на чашке до 200 колоний
продуцента.
Селективную среду расплавляют, остужают до 60 -С, добавляют
свежеприготовленный в стерильной дистиллированной воде раствор
одного из антибиотиков (левомицетин, линкомицин, цефалотин или
другой, указанные в разделе 2) для подавления посторонней
бактериальной микрофлоры и нистатина (10 мкг/мл) для подавления
грибковой флоры, тщательно перемешивают и разливают по 10 - 15 мл
в стеклянные чашки Петри на горизонтальной поверхности. Чашки с
застывшей средой помещают в термостат на сутки при температуре 37
-С, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные чашки
используют для контроля воздуха.
После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат при
28 -С. Через 72 ч производят подсчет выросших типичных колоний
продуцента. При необходимости культуру подвергают
микроскопированию.
10. Вычисление результатов измерений
Расчет концентрации клеток продуцента в пересчете на 1 куб. м
воздуха производят по формуле:
N х 1000
X = --------, кл./куб. м,
V
где:
X - концентрация клеток продуцента в воздухе;
N - количество колоний продуцента, выросших на чашке;
1000 - коэффициент пересчета на 1 куб. м воздуха;
V - объем воздуха, л (произведение скорости на время
аспирации).
В случае невозможности использования аппарата Кротова
рекомендуется применять метод седиментации клеток продуцента из
воздуха непосредственно на чашки Петри с плотной питательной
средой. Время отбора проб воздуха может составлять до 60 мин. При
этом пользуются следующим расчетом концентрации клеток продуцента:
эмпирически установлено, что за 5 мин. на площадь 100 кв. см
оседает количество бактерий, содержащееся в 10 л воздуха, за 1 мин
- 2 л воздуха. Площадь чашки Петри диаметром 100 мм равна 78,54
кв. см.
Составляем пропорцию:
на 100 кв. см за 1 мин. оседает 2 л воздуха
на 78,54 кв. см - Х л.
Х = 1,57 л/мин.
Следовательно, на стеклянную чашку Петри за 1 мин оседает
количество бактерий, содержащееся в 1,57 л воздуха.
Надо определить количество клеток в 1 куб. м воздуха. На 1
чашку (диаметр 100 мм) за 1 мин. оседает количество микробов,
содержащееся в 1,57 л воздуха, за Т мин. - 1,57 х Тл.
В этом количестве содержится N колониеобразующих единиц
(микробных клеток - спор, обрывков мицелия), а в 1 куб. м воздуха
содержится:
N х 1000 N х 636,9
-------- = ---------.
1,57 х T T
Пример: за 30 мин. седиментации выросло 12 колоний
микроорганизма. В 1 куб. м воздуха содержится:
12 х 636,9
---------- = 253 клетки.
30
11. Оформление результатов измерений
Результаты измерений оформляют протоколом по форме.
Протокол N _____
количественного микробиологического анализа штамма
Streptomyces cinnamonensis НИЦБ 109 - продуцента монензина
в воздухе рабочей зоны
Дата проведения анализа ________________________________
Место отбора пробы _____________________________________
Название лаборатории ___________________________________
Юридический адрес организации __________________________
Результаты микробиологического анализа
-------------------T--------------------T------------------------¬
¦ Шифр или N пробы ¦ Определяемый ¦Концентрация, кл./куб. м¦
¦ ¦ микроорганизм ¦ ¦
+------------------+--------------------+------------------------+
L------------------+--------------------+-------------------------
Ответственный исполнитель
Научный руководитель
Список литературы
1. ГОСТ 12.1.005-88 "ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие
санитарно-гигиенические требования".
2. ГОСТ Р 8.563-96 "ГСИ. Методики выполнения измерений".
3. Положение об организации работы по технике безопасности в
микробиологической промышленности (М., 1980, 27 с.).
4. Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной
гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий
микробиологической промышленности (М., 1977, 7 с.).
|
