Утверждаю
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации,
Первый заместитель
Министра здравоохранения
Российской Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
24 октября 2003 года
Дата введения:
1 декабря 2003 года
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
МЕТОД МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ИЗМЕРЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ КЛЕТОК
ASPERGILLUS AWAMORI ВНИИГЕНЕТИКА 120/177 - ПРОДУЦЕНТА
ГЛЮКОАМИЛАЗЫ В АТМОСФЕРНОМ ВОЗДУХЕ НАСЕЛЕННЫХ МЕСТ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
МУК 4.2.1767-03
1. Разработаны Российским государственным медицинским
университетом (к.б.н. Н.И. Шеиной).
2. Утверждены Первым заместителем министра здравоохранения
Российской Федерации - Главным государственным санитарным врачом
Российской Федерации 24 октября 2003 г.
3. Введены в действие с 1 декабря 2003 г.
4. Введены впервые.
1. Общие положения и область применения
Настоящие Методические указания устанавливают методику
проведения микробиологического количественного анализа
концентрации клеток штамма Aspergillus awamori ВНИИгенетика
120/177 - продуцента глюкоамилазы в атмосферном воздухе населенных
мест в диапазоне концентраций от 100 до 5000 клеток в 1 куб. м
воздуха.
Методические указания разработаны в соответствии с
требованиями ГОСТ 17.2.4.02-81 "Охрана природы. Атмосфера. Общие
требования к методам определения загрязняющих веществ" и ГОСТ Р
8.563-96 "Методики выполнения измерений".
Методические указания предназначены для применения в
лабораториях предприятий, организаций и учреждений,
аккредитованных в установленном порядке на право проведения
микробиологических исследований.
Методические указания одобрены и рекомендованы секцией
"Гигиенические аспекты биотехнологии и микробного загрязнения
окружающей среды" Проблемной комиссии "Научные основы гигиены
окружающей среды".
2. Биологическая характеристика Aspergillus awamori
ВНИИгенетика 120/177 и его гигиенический норматив
На 5 день развития на сусло-агаре штамм образует крупные
ровные круглые колонии, средний диаметр которых составляет 0,5 -
1,0 см, а максимальный - 1,5 - 3,0 см. Край колоний ровный.
Колонии гомогенные, гладкие, плоские.
При температуре 38 - 42 -С штамм-продуцент появляется на
сусло-агаре в виде маленьких белых колоний уже на 1 - 2 дни. На 3
день в среду выделяется оранжево-желтый пигмент, процесс
спорообразования идет интенсивнее. Образование конидиеносцев с
конидиями придает колониям глубокий интенсивно-серый цвет. Колонии
становятся опушенными и приподнимаются над средой.
Систематическое положение микроорганизма
Класс Fungi imperfecti
Порядок Hyphomycetales
Семейство Mucedinaceae
Секция Monoverticillata
Род Aspergillus
Вид awamori
Штамм ВНИИгенетика 120/177
Штамм Aspergillus awamori 120/177 получен во ВНИИгенетика как
мутант из Asp. awamori С529Д 466 и депонирован в ЦМПМ института.
Штамм является продуцентом глюкоамилазы.
Штамм-продуцент растет на жидких и агаризованных средах.
Оптимальная температура роста 27 - 30 -С, рН среды - 5,0 - 6,0,
культивирование 7 суток. Для размножения используется
агаризованная среда Чапека, сусло-агар 5 - 6 -Б,
картофельно-сахарозный агар.
Предельно допустимая концентрация (ПДК) в атмосферном воздухе
населенных мест - 200 кл./куб. м, пометка А.
3. Пределы измерений
Методика обеспечивает выполнения измерений количества клеток
плесневого гриба в атмосферном воздухе населенных мест в диапазоне
концентраций от 100 до 5000 клеток в 1 куб. м воздуха при
доверительной вероятности 0,95.
4. Метод измерений
Метод основан на аспирации из воздуха клеток плесневого гриба
на поверхность среды сусло-агар и подсчета выросших колоний по
типичным культурально-морфологическим признакам и яркому
оранжево-желтому окрашиванию субстрата на 3 сутки.
5. Средства измерений, вспомогательные устройства,
реактивы и материалы
При выполнении измерений применяют следующие средства
измерений, вспомогательные устройства и материалы.
5.1. Средства измерений, вспомогательные устройства,
материалы
Прибор для бактериологического анализа ТУ 64-12791-77
воздуха, модель 818 (щелевой прибор Кротова)
Термостаты электрические суховоздушные
или водяные
Автоклав электрический ГОСТ 9586-75
Бокс, оборудованный бактерицидными лампами
Холодильник бытовой
Весы лабораторные аналитические типа ВЛА-200
Микроскоп биологический с иммерсионной
системой типа "Биолам" Л-211
Лупа с увеличением х10 ГОСТ 25706-83
Чашки Петри бактериологические плоскодонные,
стеклянные, диаметром 100 мм
Пробирки биологические вместимостью 20 и 35 мл ГОСТ 10515-75
Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл ГОСТ 10515-75
Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл ГОСТ 1770-74
Колбы конические вместимостью 250 и 500 мл ГОСТ 1770-74
Секундомер ГОСТ 9586-75
Барометр ГОСТ 24696-79
Марля медицинская ГОСТ 9412-77
Вата медицинская гигроскопическая ГОСТ 25556-81
5.2. Реактивы, растворы
Среда сусло-агар: солодовое сусло
(значение Баллинга от 5 до 6-) - 98%,
агар-агар - 2%, рН среды 5,0 - 6,0,
режим стерилизации: Р - 0,8 кгс/кв. см, 40 мин.
Спирт этиловый ректификат ГОСТ 5962-67
Молочная кислота (синоним - альфа-оксипропионовая ГОСТ 490-79
кислота, для подавления посторонней
бактериальной флоры)
6. Требования безопасности
При выполнении измерений концентрации клеток штамма-продуцента
в атмосферном воздухе соблюдают следующие требования:
6.1. Правила техники безопасности при работе с химическими
реактивами по ГОСТ 12.1.005-88.
6.2. Электробезопасность при работе с электроустановками по
ГОСТ 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора.
6.3. "Инструкции по устройству, требованиям безопасности и
личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях
предприятий микробиологической промышленности" (1977).
6.4. Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном
шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом
осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.
7. Требования к квалификации операторов
К выполнению измерений и обработке их результатов допускают
лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших
соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области
микробиологических исследований.
8. Условия измерений
Процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу
проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20 +/- 5
-С), атмосферном давлении 630 - 800 мм рт. ст. и влажности воздуха
не более 80%.
9. Проведение измерения
9.1. Условия отбора проб воздуха
Для определения концентрации клеток плесневого гриба воздух
аспирируют при помощи аппарата Кротова со скоростью 10 л/мин. на
поверхность среды сусло-агар. Время аспирации воздуха (5 - 20
мин.) зависит от предполагаемой концентрации клеток
штамма-продуцента.
Аппарат Кротова перед каждым отбором пробы воздуха тщательно
протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность
подвижного диска и внутреннюю стенку прибора; наружную и
внутреннюю стенку крышки. На подвижной диск устанавливают
подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее
крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой
недопустимо. После отбора пробы воздуха и остановки диска, прибор
открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от
данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку
контроля, время аспирации и дату отбора пробы.
9.2. Выполнение анализа
Метод предполагает учет количества типичных колоний, выросших
на 3 сутки после посева проб воздуха, по
культурально-морфологическим признакам и яркой оранжево-желтой
пигментации среды. Прямой метод позволяет учитывать на чашке до
200 колоний продуцента.
Агаризованную среду сусло-агар расплавляют, остужают до 50 -
60 -С, добавляют молочную кислоту из расчета 2 мл на 0,5 л среды
(для подавления посторонней бактериальной микрофлоры), тщательно
перемешивают и разливают по 10 мл в стеклянные чашки Петри на
горизонтальной поверхности.
Чашки с застывшей средой помещают в термостат на сутки при
температуре 37 -С, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные
чашки используют для контроля воздуха.
После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат при
температуре 38 - 42 -С (повышенная температура способствует более
быстрому росту колоний и плодоношений рода Aspergillus). Через 2 -
3 суток производят подсчет выросших типичных колоний продуцента.
При необходимости культуру подвергают микроскопированию.
10. Вычисление результатов измерения
Расчет концентрации клеток продуцента в пересчете на 1 куб. м
воздуха производят по формуле:
N х 1000
X = --------, кл./куб. м,
V
X - концентрация клеток продуцента в воздухе;
N - количество колоний продуцента, выросших на чашке;
1000 - коэффициент пересчета на 1 куб. м воздуха;
V - объем воздуха, л (произведение скорости на время
аспирации).
11. Оформление результатов измерений
Результаты измерений оформляют протоколом по форме.
Протокол N
количественного микробиологического анализа
штамма-продуцента Aspergillus awamori ВНИИгенетика 120/177
в атмосферном воздухе населенных мест
1. Дата проведения анализа _______________________________
2. Место отбора пробы ____________________________________
3. Название лаборатории __________________________________
4. Юридический адрес лаборатории _________________________
Результаты микробиологического анализа
-----------------T-----------------------T-----------------------¬
¦Шифр или N пробы¦ Определяемый ¦ Концентрация, ¦
¦ ¦ микроорганизм ¦ кл./куб. м ¦
+----------------+-----------------------+-----------------------+
L----------------+-----------------------+------------------------
Ответственный исполнитель
Научный руководитель
Список литературы
1. Руководство по контролю загрязнения атмосферы: РД
52.04.186-96. М., 1991. 693 с.
2. ГОСТ Р 8.563-96. ГСИ "Методики выполнения измерений".
3. Положение об организации работы по технике безопасности в
микробиологической промышленности. М., 1980. 27 с.
4. Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной
гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий
микробиологической промышленности. М., 1977. 7 с.
5. ГОСТ 17.2.4.02-81 "Охрана природы. Атмосфера. Общие
требования к методам определения загрязняющих веществ".
6. Влодавец В.В. К определению плесневых грибов рода
Aspergillus в воздухе лечебных учреждений//Гиг. и сан., 1988. N 8.
93 - 95 с.
7. Бабьева И.П., Зенова Г.М. Биология почв. М.: МГУ. 122 с.
|
