Утверждаю
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации,
Первый заместитель
Министра здравоохранения
Российской Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
24 октября 2003 года
Дата введения -
1 декабря 2003 года
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
МЕТОД МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ИЗМЕРЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ
КЛЕТОК CANDIDA TROPICALIS Y-456 - ПРОДУЦЕНТА КСИЛИТА
В АТМОСФЕРНОМ ВОЗДУХЕ НАСЕЛЕННЫХ МЕСТ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
МУК 4.2.1773-03
1. Разработаны Российским государственным медицинским
университетом (к.б.н. Н.И. Шеиной).
2. Утверждены Первым заместителем министра здравоохранения
Российской Федерации - Главным государственным санитарным врачом
Российской Федерации 24 октября 2003 г.
3. Введены в действие с 1 декабря 2003 г.
4. Введены впервые.
1. Общие положения и область применения
Настоящие Методические указания устанавливают методику
проведения микробиологического количественного анализа
концентрации клеток штамма Candida tropicalis Y-456 - продуцента
ксилита в атмосферном воздухе населенных мест в диапазоне
концентраций от 10 до 3000 клеток в 1 куб. м воздуха.
Методические указания разработаны в соответствии с
требованиями ГОСТ 17.2.4.02-81 "Охрана природы. Атмосфера. Общие
требования к методам определения загрязняющих веществ" и ГОСТ Р
8.563-96 "Методики выполнения измерений".
Методические указания предназначены для применения в
лабораториях предприятий, организаций и учреждений,
аккредитованных в установленном порядке на право проведения
микробиологических исследований.
Методические указания одобрены и рекомендованы секцией
"Гигиенические аспекты биотехнологии и микробного загрязнения
окружающей среды" Проблемной комиссии "Научные основы гигиены
окружающей среды".
2. Биологическая характеристика Candida tropicalis Y-456
и его гигиенический норматив
На сусло-агаре на 2 - 3 сутки штамм образует круглые
кремоватые колонии с ровным краем, средний диаметр изолированных
колоний составляет 0,3 см, а максимальный - 0,8 см. В центре
колоний образуется небольшое возвышение - "бугорок", на среде
появляется маленькое желто-оранжевое окрашивание. Консистенция
колоний мягкая, неплотная, вязкая. Поверхность гладкая, слегка
матовая.
Морфологически штамм представлен полиморфными клетками:
округлые, овальные, большей частью одиночные 2 - 4 мкм, иногда
цепочки или конгломераты из вытянутых клеток 10 - 12 мкм.
Наблюдается обилие бластоспор.
При выращивании на кукурузном агаре по Дальмау в чашках Петри
обильно образуются псевдогифы с многократными разветвлениями и
бластоконидиями, расположенными одиночно или цепочками вдоль гиф
(8).
Систематическое положение микроорганизма
Класс Fungi imperfecti
Порядок Blaslomycelales
Род Candida
Вид tropicalis
Штамм Y-456
Штамм получен из ЦМПМ ВНИИгенетика как продуцент этанола и
селектирован по признаку формирования крупных колоний на средах с
ксилозой. Штамм является продуцентом ксилита. Продуктивность на
средах с 5% содержанием ксилозы: максимальная - 80% ксилита,
средняя - 78,8 - 76,2% (39,5 г/л) ксилита.
Штамм-продуцент растет на жидких и агаризованных средах.
Оптимальная температура роста 35 - 37 -С, рН среды - 5,0 - 6,0.
Для размножения используется сусло-агар 5 - 6 -Б, среда ДАП -
глюкоза (ксилоза) - 20 г, дрожжевой экстракт - 2,0 г, пептон - 2
г, агар-агар - 20 г, вода - 1 л, рН среды - 5,0 - 6,0.
Предельно допустимая концентрация (ПДК) в атмосферном воздухе
населенных мест - 30 кл./куб. м, пометка А.
3. Пределы измерений
Методика обеспечивает выполнения измерений количества клеток
дрожжевого гриба в атмосферном воздухе населенных мест в диапазоне
концентраций от 10 до 3000 клеток в 1 куб. м воздуха при
доверительной вероятности 0,95.
4. Метод измерений
Метод основан на аспирации из воздуха клеток дрожжеподобного
гриба на поверхность среды сусло-агар и подсчете выросших колоний
по типичным культурально-морфологическим признакам на 2 сутки
развития. В качестве дополнительного контроля предлагается отбор
пробы на чашку Петри с селективной средой для дифференцирования С.
tropicalis от других дрожжеподобных грибов, обладающих
способностью к образованию ростковых трубок (9, 10).
5. Средства измерений, вспомогательные устройства,
реактивы и материалы
При выполнении измерений применяют следующие средства
измерений, вспомогательные устройства и материалы.
5.1. Средства измерений,
вспомогательные устройства, материалы
Прибор для бактериологического анализа воздуха, ТУ 64-12791-77
модель 818 (щелевой прибор Кротова)
Термостаты электрические суховоздушные
или водяные
Автоклав электрический ГОСТ 9586-75
Бокс, оборудованный бактерицидными лампами
Холодильник бытовой
Весы лабораторные аналитические типа ВЛА-200
Микроскоп биологический с иммерсионной
системой типа "Биолам" Л-211
Лупа с увеличением х10 ГОСТ 25706-83
Чашки Петри бактериологические плоскодонные
стеклянные диаметром 100 мм
Пробирки биологические вместимостью 20 и 35 мл ГОСТ 10515-75
Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл ГОСТ 10515-75
Пипетки мерные на 1, 5, и 10 мл ГОСТ 1770-74
Колбы конические вместимостью 250 и 500 мл ГОСТ 1770-74
Секундомер ГОСТ 9586-75
Барометр ГОСТ 24696-79
Марля медицинская ГОСТ 9412-77
Вата медицинская гигроскопическая ГОСТ 25556-81
5.2. Реактивы, растворы
Среда сусло-агар: солодовое сусло (значение Баллинга от 5 до 6
-) - 98%, агар-агар - 2%, рН среды 5,0 - 6,0, режим стерилизации:
Р - 0,8 кгс/кв. см, 40 мин.
Спирт этиловый ректификат, ГОСТ 5962-67.
Сыворотка или плазма крови человека (вместо них можно
использовать среду 199).
Антибиотик биомицин (хлортетрациклина гидрохлорид).
6. Требования безопасности
При выполнении измерений концентрации клеток штамма-продуцента
в воздухе рабочей зоны соблюдают следующие требования:
6.1. Правила техники безопасности при работе с химическими
реактивами по ГОСТ 12.1.005-88.
6.2. Электробезопасность при работе с электроустановками по
ГОСТ 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора.
6.3. "Инструкции по устройству, требованиям безопасности и
личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях
предприятий микробиологической промышленности" (1977).
6.4. Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном
шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом
осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.
7. Требования к квалификации операторов
К выполнению измерений и обработке их результатов допускают
лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших
соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области
микробиологических исследований.
8. Условия измерений
Процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу
проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20 +/- 5
-С), атмосферном давлении 30 - 800 мм рт. ст. и влажности воздуха
не более 80%.
9. Проведение измерения
9.1. Условия отбора проб воздуха
Для определения концентрации клеток продуцента воздух
аспирируют при помощи аппарата Кротова со скоростью 10 л/мин. на
поверхность среды сусло-агар. Время аспирации воздуха (5 - 20
мин.) зависит от предполагаемой концентрации клеток
штамма-продуцента.
Аппарат Кротова перед каждым отбором пробы воздуха тщательно
протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность
подвижного диска и внутреннюю стенку прибора, наружную и
внутреннюю стенку крышки. На подвижной диск устанавливают
подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее
крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой
недопустимо. После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор
открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от
данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку
контроля, время аспирации и дату отбора пробы.
9.2. Выполнение анализа
Метод предполагает учет количества типичных колоний, выросших
на 2 сутки после посева проб воздуха по
культурально-морфологическим признакам. Метод позволяет учитывать
на чашке до 200 колоний продуцента.
Агаризованную среду сусло-агар расплавляют, остужают до 50 -
60 -С, тщательно перемешивают и разливают по 10 мл в стеклянные
чашки Петри на горизонтальной поверхности.
Чашки с застывшей средой помещают в термостат на сутки при
температуре 37 -С, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные
чашки используют для контроля воздуха.
После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат при
температуре 37 -С. На 2-е сутки производят подсчет выросших
типичных колоний продуцента. При необходимости культуру подвергают
микроскопированию.
Для постановки дополнительного контроля в среду добавляют
сыворотку или плазму крови человека (можно также заменить средой
199) из расчета 0,5 мл сыворотки на 5 мл среды. После отбора проб
инкубируют при 37 -С в течение 3 часов. При микроскопировании
некоторые дрожжеподобные грибы (С. albicans) в отличие от С.
tropicalis на селективной среде образуют ростковые трубки
диаметром 3 - 4 мкм и длиной до 20 мкм (они сходны с мицелием, но
не дают сужения в месте прикрепления к дрожжевой клетке).
10. Вычисление результатов измерения
Расчет концентрации клеток продуцента в пересчете на 1 куб. м
воздуха производят по формуле:
N х 1000
Х = --------, кл./куб. м,
V
где:
X - концентрация клеток продуцента в воздухе;
N - количество колоний продуцента, выросших на чашке;
1000 - коэффициент пересчета на 1 куб. м воздуха;
V - объем воздуха, л (произведение скорости на время
аспирации).
11. Оформление результатов измерений
Результаты измерений оформляют протоколом по форме:
Протокол N
количественного микробиологического анализа
штамма-продуцента Candida tropicalis Y-456
в атмосферном воздухе населенных мест
1. Дата проведения анализа _______________________________
2. Место отбора пробы ____________________________________
3. Название лаборатории __________________________________
4. Юридический адрес организации _________________________
Результаты микробиологического анализа
--------------------T-------------------T------------------------¬
¦ Шифр или N пробы ¦ Определяемый ¦Концентрация, кл./куб. м¦
¦ ¦ микроорганизм ¦ ¦
+-------------------+-------------------+------------------------+
L-------------------+-------------------+-------------------------
Ответственный исполнитель
Научный руководитель
Список литературы
1. Руководство по контролю загрязнения атмосферы: РД
52.04.186-96. М., 1991. 693 с.
2. ГОСТ Р 8.563-96. ГСИ "Методики выполнения измерений".
3. Положение об организации работы по технике безопасности
микробиологической промышленности. М., 1980. 27 с.
4. Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной
гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий
микробиологической промышленности. М., 1977. 7 с.
5. ГОСТ 17.2.4.02-81 "Охрана природы. Атмосфера. Общие
требования к методам определения загрязняющих веществ". М.: Изд-во
стандартов, 1981. 3 с.
6. Влодавец В.В., Немыря В.И. Санитарно-микологический
контроль объектов окружающей среды на предприятиях
микробиологической промышленности//Гиг. и сан., 1977. N 1. 25 - 28
с.
7. Бабьева И.П., Зенова Г.М. Биология почв. М.: МГУ. 122 с.
8. Саттон Д., Фотергилл А., Ринальди М. Определитель
патогенных и условно патогенных грибов. М.: Мир, 2001. 110 с.
9. Кашкин П.Н., Лисин В.В. Практическое руководство по
медицинской микологии. М.: Медицина, 1983. 153 с.
10. Kwon-Chung K.J., Bennett J.E. Medical mycology.
Philadelphia: Lea & Febiger, 1992. P. 61 - 62.
|
