Утверждаю
Главный государственный
санитарный врач
Российской федерации,
Первый заместитель
Министра здравоохранения
Российской Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
20 сентября 2001 года
Дата введения:
с момента утверждения
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
МЕТОД МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ИЗМЕРЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ КЛЕТОК
МИКРООРГАНИЗМА PENICILLIUM VERMICULATUM PK-1 - ПРОДУЦЕНТ
ВЕРМИКУЛЕНА В ВОЗДУХЕ РАБОЧЕЙ ЗОНЫ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
МУК 4.2.1072-01
1. Разработаны к.б.н. Бару Р.В., к.б.н. Лапчинской А.В.
(Государственный научный центр по антибиотикам).
2. Утверждены и введены в действие Главным государственным
санитарным врачом Российской Федерации - Первым заместителем
министра здравоохранения Российской Федерации 20 сентября 2001 г.
3. Введены впервые.
1. Общие положения и область применения
Настоящие методические указания устанавливают методику
проведения микробиологического количественного анализа
концентрации клеток штамма Penicillium vermiculatum PK-1 -
продуцент Вермикулена в воздухе рабочей зоны в диапазоне
концентраций от 100 до 3000 клеток в 1 куб. м воздуха.
Методические указания разработаны в соответствии с
требованиями ГОСТ 12.1.005-88 "ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие
санитарно-гигиенические требования" и ГОСТ Р 8.563-96 "Методики
выполнения измерений".
Методические указания предназначены для применения в
лабораториях предприятий, организаций и учреждений,
аккредитованных в установленном порядке на право проведения
микробиологических исследований.
2. Характеристика штамма-продуцента Вермикулена
Микроорганизм Penicillium vermiculatum PK-1 является
продуцентом Вермикулена. Биологический препарат Вермикулен
представляет собой живую культуру (споры и мицелиальная масса
микроорганизма Penicillium vermiculatum PK-1).
Penicillium vermiculatum PK-1 - аэроб, растет на жидких и
агаризованных средах, оптимальная температура роста 25 - 30 -С,
оптимальная рН от 5 до 8. Наиболее интенсивный рост гриба
отмечается на картофельно-сахарозном агаре и агаризованной среде
Чапека. На среде Чапека - Докса при культивировании при
температуре 25 -С на 2 - 3 сутки образуются небольшие (2 - 5 мм в
диаметре) округлые бархатистые колонии желто-бежеватого цвета, с
обратной стороной от светло до темно-оливкового. Репродуктивными
органами микроорганизма являются споры (конидии и обрывки
мицелия).
ПДК - 5000 кл./куб. м.
р.з.
3. Пределы измерений
Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток
продуцента Вермикулена в воздухе рабочей зоны в диапазоне
концентраций от 100 до 30000 клеток в 1 куб. м воздуха при
доверительной вероятности 0,95.
4. Метод измерений
Метод основан на аспирации из воздуха клеток продуцента
Вермикулена на поверхность плотной питательной среды и подсчете
выросших колоний по типичным морфологическим признакам.
5. Средства измерений, вспомогательные устройства,
реактивы и материалы
При выполнении измерений применяют следующие средства
измерений, вспомогательные устройства и материалы.
5.1. Средства измерений,
вспомогательные устройства, материалы
Прибор для бактериологического анализа воздуха, ТУ 64-12791-77
модель 818 (щелевой прибор Кротова)
Термостаты электрические суховоздушные или
водяные
Автоклав электрический ГОСТ 9586-75
Бокс, оборудованный бактерицидными лампами
Холодильник бытовой
Весы лабораторные аналитические типа
ВЛА-200
Микроскоп биологический с иммерсионной
системой типа "Биолам" Л-211
Лупа с увеличением х10 ГОСТ 25706-83
Чашки Петри бактериологические плоскодонные
стеклянные диаметром 100 мм
Пробирки биологические вместимостью 20 и 35 мл ГОСТ 10515-75
Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл ГОСТ 10515-75
Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл ГОСТ 1770-74
Колбы конические вместимостью 250 и 500 мл ГОСТ 1770-74
Секундомер ГОСТ 9586-75
Барометр ГОСТ 24696-79
Марля медицинская ГОСТ 9412-77
Вата медицинская гигроскопическая ГОСТ 25556-81.
5.2. Реактивы, растворы
Антибиотики группы аминогликозидов (канамицин,
неомицин и др.)
Спирт этиловый ректификат ГОСТ 5962-67
Селективная среда Чапека - Докса для штамма -
продуцента: NaNО - 3,0 г; MgSО К НРО - 1,0 г;
3 4 2 4
KCL - 0,5 г; MgSО х 7Н О - 0,5 г; FeSО х 7Н О -
4 2 4 2
0,01 г; сахароза - 30 г; агар - 20 г; вода
дистиллированная - до 1000 мл; рН - 6,0;
стерилизация при 121 -С 30 мин.
6. Требования безопасности
При выполнении измерений концентрации клеток продуцента
Вермикулена в воздухе рабочей зоны соблюдают:
- правила техники безопасности при работе с химическими
реактивами по ГОСТ 12.1.005-88;
- правила электробезопасности при работе с электроустановками
по ГОСТ 12.1.019-79 и инструкцию по эксплуатации прибора;
- требования, изложенные в руководстве "Положение об
организации работы по технике безопасности в микробиологической
промышленности" (1980);
- положения "Инструкций по устройству, требованиям
безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических
лабораториях предприятий микробиологической промышленности"
(1977).
Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу
при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом
осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.
7. Требования к квалификации операторов
К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются
лица с высшим или средним специальным образованием, прошедшие
соответствующую подготовку и имеющие навыки работы в области
микробиологических исследований.
8. Условия измерений
Процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу
проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20 +/- 5)
-С, атмосферном давлении 630 - 800 мм рт. ст. и влажности воздуха
не более 80%.
9. Проведение измерения
9.1. Условия отбора проб воздуха
Для определения продуцента Вермикулена воздух аспирируют при
помощи аппарата Кротова со скоростью 10 л/мин. на поверхность
плотной питательной среды. Время аспирации воздуха (1 - 10 мин.)
зависит от предполагаемой концентрации клеток продуцента.
Аппарат Кротова перед каждым отбором пробы воздуха тщательно
протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность
подвижного диска и внутреннюю стенку прибора, наружную и
внутреннюю стенку крышки. На подвижный диск устанавливают
подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее
крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой
недопустимо. После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор
открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от
данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку
контроля, время аспирации и дату отбора пробы.
9.2. Выполнение анализа
Метод предполагает учет количества типичных по морфологическим
признакам колоний, выросших на 2 - 3 сутки после посева воздуха.
Прямой метод позволяет учитывать на чашке до 200 колоний
продуцента.
Селективную среду расплавляют, остужают до 60 -С, добавляют
свежеприготовленный в стерильной дистиллированной воде раствор
антибиотика (канамицин, неомицин) из расчета 25 - 50 мкг на 1 мл
среды (для подавления посторонней бактериальной микрофлоры),
тщательно перемешивают и разливают по 10 - 15 мл в стеклянные
чашки Петри на горизонтальной поверхности. Чашки с застывшей
средой помещают в термостат на сутки при температуре 37 -С, после
чего проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для
контроля воздуха.
После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат на
25 -С. Через 48 - 72 ч производят подсчет выросших типичных
колоний продуцента. При необходимости культуру подвергают
микроскопированию.
10. Вычисление результатов измерения
Расчет концентрации клеток продуцента в пересчете на 1 куб. м
воздуха производят по формуле:
N х 1000
X = --------, кл./куб. м,
V
где:
X - концентрация клеток продуцента в воздухе;
N - количество колоний продуцента, выросших на чашке;
1000 - коэффициент пересчета на 1 куб. м воздуха;
V - объем воздуха, л (произведение скорости на время
аспирации).
В случае невозможности использования аппарата Кротова,
рекомендуется применять метод седиментации клеток продуцента из
воздуха непосредственно на чашки Петри с плотной питательной
средой. Время отбора проб воздуха может составлять до 60 мин. (при
определении концентрации микроорганизма в атмосферном воздухе).
При использовании этого метода пользуются следующим расчетом
концентрации клеток продуцента:
эмпирически установлено, что за 5 мин. на площадь 100 куб. см
оседает количество бактерий, содержащееся в 10 л воздуха, за 1
мин. - в 2 л воздуха. Площадь чашки Петри диаметром 100 мм равна
78,54 куб. см.
Составляем пропорцию:
на 100 куб. см за 1 мин. оседает 2 л воздуха
на 78,54 куб. см - Х л
Х = 1,57 л/мин.
Следовательно, на стеклянную чашку Петри за 1 мин. оседает
1,57 л воздуха.
Надо определить количество клеток в 1 куб. м воздуха.
На 1 чашку (диаметр 100 мм) за 1 мин. оседает количество
микробов, содержащихся в 1,57 л воздуха, за Т мин. - 1,57 х Т л.
В этом количестве содержится N колониеобразующих единиц
(микробных клеток - спор, обрывков мицелия), а в 1 куб. м воздуха
содержится:
N х 1000 N х 636,9
-------- = ---------.
1,57 х Т Т
Пример: за 30 мин. седиментации выросло 12 колоний
микроорганизма. В 1 куб. м воздуха содержится:
12 х 636,9
---------- = 253 клетки.
30
11. Оформление результатов измерений
Результаты измерений оформляют протоколом по форме.
Протокол N ___
количественного микробиологического анализа штамма
Penicillium vermiculatum PK-1 - продуцента Вермикулена
в воздухе рабочей зоны
Дата проведения анализа _________________________________
Место отбора пробы ______________________________________
Название лаборатории ____________________________________
Юридический адрес организации ___________________________
Результаты микробиологического анализа
--------------------T----------------------T---------------------¬
¦ Шифр или N пробы ¦ Определяемый ¦ Концентрация, ¦
¦ ¦ микроорганизм ¦ кл./куб. м ¦
+-------------------+----------------------+---------------------+
L-------------------+----------------------+----------------------
Ответственный исполнитель
Научный руководитель
Список литературы
1. ГОСТ 12.1.005-88 "ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие
санитарно-гигиенические требования".
2. ГОСТ Р 8.563-96 "ГСИ. Методики выполнения измерений".
3. Положение об организации работы по технике безопасности в
микробиологической промышленности (М., 1980, 27 с.).
4. Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной
гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий
микробиологической промышленности (М., 1977, 7 с.).
|
