Утверждаю
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации,
Первый заместитель
Министра здравоохранения
Российской Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
20 декабря 2000 года
Дата введения:
с момента утверждения
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
МЕТОД МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ИЗМЕРЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ КЛЕТОК
МИКРООРГАНИЗМА PSEUDOMONAS FLUORESCENS (DENITRIFICANS)
В 99 - ПРОДУЦЕНТА ВИТАМИНА В12 В АТМОСФЕРНОМ ВОЗДУХЕ
НАСЕЛЕННЫХ МЕСТ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
МУК 4.2.1004-00
1. Разработаны к.б.н. Бару Р.В., к.б.н. Лапчинской А.В.
(Государственный научный центр по антибиотикам).
2. Утверждены и введены в действие Главным государственным
санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем
министра здравоохранения Российской Федерации 20 декабря 2000 г.
3. Введены впервые.
1. Общие положения и область применения
Настоящие Методические указания устанавливают методику
проведения микробиологического количественного анализа
концентрации клеток штамма Pseudomonas fluorescens (denitrificans)
В 99 - продуцента витамина В в атмосферном воздухе населенных
12
мест в диапазоне концентраций от 100 до 3000 клеток в 1 куб. м
воздуха.
Методические указания разработаны в соответствии с
требованиями ГОСТов 17.2.4.02-81 "Охрана природы. Атмосфера. Общие
требования к методам определения загрязняющих веществ" и ГОСТ Р
8.563-96 "Методики выполнения измерений".
Методические указания предназначены для применения в
лабораториях предприятий, организаций и учреждений,
аккредитованных в установленном порядке на право проведения
микробиологических исследований.
Методические указания одобрены и рекомендованы секцией
"Гигиенические аспекты биотехнологии и микробного загрязнения
окружающей среды" Проблемной комиссии "Научные основы гигиены
окружающей среды".
2. Характеристика штамма-продуцента витамина В12
Микроорганизм Pseudomonas fluorescens (denitrificans) В 99
является продуцентом витамина В . Штамм растет на агаризованных
12
средах на основе мелассы при температуре 28 -С. В течение 3-х
суток образует округлые колонии 1 - 2 мм белого цвета.
Морфологически представляет собой грамотрицательные подвижные
палочки размером 0,45 - 0,85 х 0,6 мкм. Штамм устойчив к следующим
антибиотикам: левомицетину, линкомицину, полимиксину М,
ристомицину, цефалотину и эритромицину.
Предельно допустимая концентрация (ПДК) в атмосферном воздухе
населенных мест - 200 кл./куб. м.
3. Пределы измерений
Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток
продуцента витамина В в атмосферном воздухе населенных мест в
12
диапазоне концентраций от 100 до 3000 клеток в 1 куб. м воздуха
при доверительной вероятности 0,95.
4. Метод измерений
Метод основан на аспирации из воздуха клеток продуцента
витамина В на поверхность плотной питательной среды и подсчете
12
выросших колоний по типичным морфологическим признакам.
5. Средства измерений, вспомогательные устройства,
реактивы и материалы
При выполнении измерений применяют следующие средства
измерений, вспомогательные устройства и материалы.
5.1. Средства измерений, вспомогательные
устройства, материалы
Прибор для бактериологического анализа воздуха,
модель 818 (щелевой прибор Кротова) ТУ 64-12791-77
Термостаты электрические суховоздушные
или водяные
Автоклав электрический ГОСТ 9586-75
Бокс, оборудованный бактерицидными лампами
Холодильник бытовой
Весы лабораторные аналитические типа ВЛА-200
Микроскоп биологический с иммерсионной
системой типа "Биолам" Л-211
Лупа с увеличением х 10 ГОСТ 25706-83
Чашки Петри бактериологические плоскодонные
стеклянные диаметром 100 мм
Пробирки биологические вместимостью 20 и 35 мл ГОСТ 10515-75
Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл ГОСТ 10515-75
Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл ГОСТ 1770-74
Колбы конические вместимостью 250 и 500 мл ГОСТ 1770-74
Секундомер ГОСТ 9586-75
Барометр ГОСТ 24696-79
Марля медицинская ГОСТ 9412-77
Вата медицинская гигроскопическая ГОСТ 25556-81
5.2. Реактивы, растворы
Антибиотики: левомицетин, линкомицин, полимиксин М, цефалотин,
эритромицин.
Спирт этиловый ректификат ГОСТ 5962-67
Селективная среда для штамма-продуцента
Среда: меласса - 100 - 150 г; (NH ) HPO - 1,3 г; MgSO 7Н O -
4 2 4 4 2
1,0 г; (NH ) SO - 0,5 г; MnSO H O - 0,1 г; ZnSO 7H O - 0,1 г;
4 2 4 4 2 4 2
агар Difco - 20 г; вода дистиллированная - до 1000 мл; рН - 6,8 -
7,0; стерилизация 121 -С, 30 мин.
6. Требования безопасности
При выполнении измерений концентрации клеток продуцента
витамина В в атмосферном воздухе населенных мест соблюдают
12
следующие требования.
6.1. Правила техники безопасности при работе с химическими
реактивами по ГОСТу 12.1.005-88.
6.2. Электробезопасность при работе с электроустановками по
ГОСТу 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора.
6.3. "Инструкции по устройству, требованиям безопасности и
личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях
предприятий микробиологической промышленности" (1977).
6.4. Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном
шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом
осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.
7. Требования к квалификации операторов
К выполнению измерений и обработке их результатов допускают
лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших
соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области
микробиологических исследований.
8. Условия измерений
Процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу
проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20 +/- 5
-С), атмосферном давлении 630 - 800 мм рт. ст. и влажности воздуха
не более 80%.
9. Проведение измерения
9.1. Условия отбора проб воздуха
Для определения продуцента витамина В воздух аспирируют при
12
помощи аппарата Кротова со скоростью 10 л/мин. на поверхность
плотной питательной среды. Время аспирации воздуха (5 - 20 мин.)
зависит от предполагаемой концентрации клеток продуцента.
Аппарат Кротова перед каждым отбором пробы воздуха тщательно
протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность
подвижного диска и внутреннюю стенку прибора, наружную и
внутреннюю стенки крышки. На подвижной диск устанавливают
подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее
крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой
недопустимо. После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор
открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от
данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку
контроля, время аспирации и дату отбора пробы.
9.2. Выполнение анализа
Метод предполагает учет количества типичных по морфологическим
признакам колоний, выросших на 2 - 3 сутки после посева воздуха.
Прямой метод позволяет учитывать на чашке до 200 колоний
продуцента.
Селективную среду расплавляют, остужают до 60 -С, добавляют
свежеприготовленный в стерильной дистиллированной воде раствор
антибиотика (левомицетин, линкомицин, цефалотин и др.) из расчета
30 мкг на 1 мл среды (для подавления посторонней бактериальной
микрофлоры), тщательно перемешивают и разливают по 10 мл в
стеклянные чашки Петри на горизонтальной поверхности. Чашки с
застывшей средой помещают в термостат на сутки при температуре 37
-С, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные чашки
используют для контроля воздуха.
После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат на
28 -С. Через 48 - 72 ч производят подсчет выросших типичных
колоний продуцента. При необходимости культуру подвергают
микроскопированию.
10. Вычисление результатов измерения
Расчет концентрации клеток продуцента в пересчете на 1 куб. м
воздуха производят по формуле:
N х 1000
Х = --------, кл./куб. м,
V
где:
Х - концентрация клеток продуцента в воздухе;
N - количество колоний продуцента, выросших на чашке;
1000 - коэффициент пересчета на 1 куб. м воздуха;
V - объем воздуха, л (произведение скорости на время
аспирации).
В случае невозможности использования аппарата Кротова
рекомендуется применять метод седиментации клеток продуцента из
воздуха непосредственно на чашки Петри с плотной питательной
средой. Время отбора проб воздуха может составлять до 60 мин. (при
определении концентрации микроорганизма в атмосферном воздухе).
При использовании этого метода применяют следующий расчет
концентрации клеток продуцента:
эмпирически установлено, что за 5 мин. на площадь 100 кв. см
оседает количество бактерий, содержащееся в 10 л воздуха, за 1
мин. - 2 л воздуха. Площадь чашки Петри диаметром 100 мм (радиус 8
см) равна 78,54 кв. см.
Составляем пропорцию:
на 100 кв. см за 1 мин. оседает 2 л воздуха
на 78,54 кв. см - Х л
Х = 1,57 л/мин.
Следовательно, на стеклянную чашку Петри за 1 мин. оседает
1,57 л воздуха.
Надо определить количество клеток в 1 куб. м воздуха.
На 1 чашку (диаметр 100 мм) за 1 мин. оседает количество
микробов, содержащихся в 1,57 л воздуха, за Т мин. - 1,57 х Т л.
В этом количестве содержится N колониеобразующих единиц
(микробных клеток - спор, обрывков мицелия), а в 1 куб. м воздуха
содержится:
N х 1000 N х 636,9
-------- = ---------.
1,57 х Т Т
Пример: за 30 мин. седиментации выросло 12 колоний
микроорганизма. В 1 куб. м воздуха содержится:
12 х 636,9
---------- = 253 клетки.
30
11. Оформление результатов измерений
Результаты измерений оформляют протоколом по форме.
Протокол N
количественного микробиологического анализа
штамма-продуцента Pseudomonas fluorescens (denitrificans)
В 99 в атмосферном воздухе
1. Дата проведения анализа ___________________________
2. Место отбора пробы ________________________________
3. Название лаборатории ______________________________
4. Юридический адрес организации _____________________
Результаты микробиологического анализа
-----------------------T---------------------T-------------------¬
¦ Шифр или N пробы ¦ Определяемый ¦ Концентрация, ¦
¦ ¦ микроорганизм ¦ кл./куб. м ¦
+----------------------+---------------------+-------------------+
L----------------------+---------------------+--------------------
Ответственный исполнитель
Научный руководитель
Список литературы
1. Руководство по контролю загрязнения атмосферы: РД
52.04.186-96. М., 1991. 693 с.
2. ГОСТ Р 8.563-96. ГСИ. Методики выполнения измерений.
3. ГОСТ 17.2.4.02-81. Охрана природы. Атмосфера. Общие
требования к методам определения загрязняющих веществ. М.: Изд-во
стандартов, 1981. 3 с.
|
