Утверждаю
Первый заместитель Министра
здравоохранения России
Г.Г.ОНИЩЕНКО
3 февраля 1997 г. N МУ-8-12
МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
ПО ДЕТЕКЦИИ БРУЦЕЛЛ В РАЗЛИЧНОМ БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ
С ПОМОЩЬЮ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ
Аннотация
Методические рекомендации предназначены для работников
научно-исследовательских и практических учреждений, занимающихся
вопросами идентификации микроорганизмов.
Рекомендации разработали сотрудники Иркутского
научно-исследовательского противочумного института Сибири и
Дальнего Востока М.Ю. Шестопалов, С.В. Балахонов, А.И.
Калиновский.
Введение
Сохраняющаяся высокая заболеваемость бруцеллезом людей и
животных оставляет актуальным вопрос о ранней и эффективной
диагностике этого заболевания. Существующие методы либо длительны
и многоэтапны (бактериологический), либо не исключают перекрестных
ложноположительных результатов с представителями других таксонов
бактерий, имеющих антигенное сходство с бруцеллами (комплекс
иммунологических тестов).
Перспективным подходом к решению этого вопроса в лабораторной
диагностике является использование полимеразной цепной реакции
(ПЦР), превосходящей на несколько порядков по чувствительности и
специфичности традиционные иммунологические тесты и позволяющей
работать с исследуемым материалом без выделения чистой культуры.
Данный метод дает возможность обнаруживать единичные клетки
бруцелл в различном биологическом материале: крови, сыворотке
крови, молоке, моче, гистологическом материале, объектах
окружающей среды в ранние - от 4 до 6 часов - сроки,
высокоспецифичен и максимально адаптирован к существующей
лабораторной базе.
Принцип метода
Полимеразная цепная реакция открывает возможность многократно
амплифицировать (синтезировать) в пробирке участок хромосомной ДНК
бруцелл размером 269 пар, нуклеотидов, являющейся фрагментом гена
оболочечного белка, с молекулярной массой 31 кД. Фрагмент,
специфичный только для микроорганизмов рода Brucella, ограничен
парой олигонуклеотидных праймеров, с которых термостабильная
ДНК-полимераза осуществляет синтез этого участка ДНК в присутствии
4-дезоксинуклеозидтрифосфатов (dNTP) и солевого буфера,
2+
содержащего ионы магния (Mg ) и бычий сывороточный альбумин
(BSA).
Синтез возможен только тогда, когда вносимая ДНК, выделенная
из исследуемой пробы, окажется идентичной (комплементарной)
праймерам, в противном случае амплификации не будет. Результат
амплификации легко визуализируется, например, методом
электрофореза в агарозном геле.
ПЦР состоит из цикла повторяющихся температурных режимов:
94 -С - 35 сек. - денатурация (расхождение) двойной цепи
исследуемой ДНК до двух одиночных;
52 -С - 35 сек. - присоединение ("отжиг") праймеров к
идентичным участкам на одиночных цепях исследуемой ДНК;
72 -С - 35 сек. - синтез специфичного участка ДНК,
Tag-полимеразой, путем удлинения праймеров.
За каждый такой цикл происходит удвоение числа копий этого
n
участка ДНК, что можно выразить как 2 , где n - количество циклов
амплификации. Таким образом, за 40 - 50 циклов амплифицируется
фрагмент ДНК, в достаточном количестве для обнаружения его методом
гель-электрофореза.
В целом же вся процедура ПЦР-диагностики состоит из 3 этапов:
1) Выделение ДНК из исследуемого материала
2) ПЦР
3) Учет результатов ПЦР.
Лабораторное оборудование
1. Микроцентрифуга на 12000 - 14000 об./мин.
2. Автоматические микропипетки на 20, 200 и 1000 мкл
3. Одноразовые наконечники к пипеткам на 200 мкл
4. Наконечники к пипеткам на 1000 мкл
5. Пластиковые микропробирки объемом 500 мкл
6. Пластиковые микропробирки объемом 1500 мкл
7. ДНК-амплификатор с программным обеспечением (МС-2) или
аналогичный
8. УФ-трансиллюминатор
9. Фотоаппарат с красным или оранжевым светофильтром
10. Негативная фотопленка (типа ФН-64, "Микрат-300")
11. Аппарат для горизонтального гель-электрофореза
12. Источник напряжения постоянного тока.
Химические реактивы
NaOH (категории х.ч. или ч.д.а.)
NaCl (х.ч.)
96% этанол
Трис-ОН (Трис-основной, м.в. 121.1)
ЭДТА x Na ("Трилон-Б")
2
H BO (Борная кислота)
3 3
Агароза (желательно использовать агарозу с низким
электроэндоосмосом и высокой плотностью геля, например, фирмы
SIGMA type 1 или 2)
Бромистый этидий
Мертиолят натрия
HCl концентрированная
Бромфеноловый синий
Глицерин.
Растворы для выделения ДНК из проб
10 М NaOH (хранить в полиэтиленовом флаконе)
5 М NaCl
96% этанол
80% этанол
ТЕ-буфер: 10 мМ Трис-HCl, pH 7,0, 1 мМ ЭДТА (стерилизовать
автоклавированием).
Компоненты для проведения ПЦР и гель-электрофореза
1. Солевой ПЦР-буфер для проведения амплификации 10х:
100 мМ Трис-HCl, pH 8,5 при 37 -С
100 мМ MgCl
2
1000 мМ KCl
2. 2,5 мМ раствор dNTP
3. Водный раствор BSA 2 мг/мл
4. Дистиллированная или бидистиллированная вода
5. Олигонуклеотидные праймеры:
Bru 1 5'-GCA GTC AGA CGT TGC CTA TT-3'
Bru 2 5'-GTC TGA GGT GTT CAG CCT Т-3'.
Приготовление лизирующего раствора и выделение ДНК из проб
Приготовление растворов, выделение ДНК, ПЦР и
гель-электрофорез осуществляют в раздельных помещениях для
предотвращения контаминации компонентов, проб и оборудования.
Для выделения ДНК из одной пробы объемом 10 мкл приготавливают
щелочной, лизирующе-осаждающий раствор следующего состава:
1. 13 мкл 10 М NaOH
2. 22 мкл дистиллированной воды
3. 3 мкл 5 М NaCl
4. 144 мкл 96% этанола.
Общий объем этой смеси составляет 182 мкл. Данный раствор
можно приготовить в отдельных пробирках объемом 1,5 мл
(последовательно добавляя все четыре указанных компонента) перед
внесением в них проб, либо в отдельном полиэтиленовом или
пластиковом флаконе с расчетом на все число проб плюс одна
(учитывая погрешности микропипеток). Щелочной раствор
приготавливают перед выделением ДНК из проб и впрок не
заготавливают.
Исследуемую пробу объемом 10 мкл добавляют в микроцентрифужную
пробирку на 1,5 мл, содержащую 182 мкл щелочного,
лизирующе-осаждающего раствора и сразу же перемешивают путем
легкого встряхивания. Пробирку выдерживают при комнатной
температуре 10 - 15 мин. Пробу центрифугируют 5 мин. при 12000 -
14000 об./мин., супернатант сливают, остаткам раствора в пробирке
дают стечь на фильтровальную бумагу.
К осадку на дне пробирки (который может быть малозаметен)
добавляют 500 мкл 80% этанола, пробирку несколько раз осторожно
переворачивают и центрифугируют 2 минуты при 12000 - 14000
об./мин. Этанол сливают, а пробирку подсушивают на фильтровальной
бумаге в течение 5 - 10 мин. К осадку добавляют 30 мкл ТЕ-буфера
или дистиллированной воды и содержимое пробирки перемешивают путем
пипетирования в отдельном стерильном наконечнике.
Примечания. 1. ДНК можно выделять из проб менее и более 10 мкл
- тогда соответственно необходимо сделать количественный пересчет
компонентов щелочного, лизирующе-осаждающего раствора.
2. Выделенные препараты ДНК можно хранить в условиях
холодильника в течение 1 месяца.
Проведение ПЦР
ПЦР проводят только в одноразовых микропробирках с
использованием одноразовых наконечников для внесения всех
компонентов амплификационной смеси.
Подготавливают и пронумеровывают пробирки на 500 мкл по числу
исследуемых проб, плюс три пробирки: для положительного и
отрицательного контролей и разведенной в 10 раз дистилированной
водой Tag-ДНК-полимеразы.
На одну пробу готовят амплификационную смесь объемом 25 мкл
следующего состава:
1) 1 мкл ПЦР-буфера
2) 1 мкл dNTP
3) 1 мкл BSA
4) Дистиллированной воды до 20 мкл, в зависимости от
количества вносимых, праймеров
5) 4 pmol (пикомоля) каждого праймера
6) 0,2 мкл Tag-ДНК-полимеразы в 2 мкл дистиллированной воды
7) 3 мкл исследуемой пробы.
Исследуемую пробу всегда вносят в последнюю очередь, после
чего всю смесь перемешивают пипетированием и закрывают 85 мкл
вазелинового масла (три капли из наконечника объемом 200 мкл). В
качестве положительного контроля используют ДНК B. melitensis
Rev-1 или B. abortus 19-BA, выделенные описанным щелочным методом,
в отрицательном контроле используется дистиллированная вода вместо
анализируемой пробы.
Пробирки закрывают и помещают в амплификатор со следующей
температурно-временной программой одного цикла:
94 -С - 35 сек.;
52 -С - 35 сек.;
72 -С - 35 сек.
Количество циклов 50. За это время в каждом цикле происходит
удвоение числа копий ограниченного праймерами участка хромосомной
ДНК, причем, каждая вновь синтезируемая цепь становится матрицей
для присоединения праймеров и снова амплифицируется, что позволяет
за 50 циклов синтезировать фрагмент ДНК в количестве достаточном
для обнаружения его с помощью электрофореза в агарозном геле.
Примечания. 1. Солевой ПЦР-буфер, раствор dNTP, раствор BSA,
праймеры, Tag-ДНК-полимераза обязательно хранят в морозильнике и
размораживают (кроме Tag-ДНК-полимеразы) перед приготовлением
амплификационной смеси.
2. Амплификационную смесь, состоящую из ПЦР-буфера, dNTP, BSA
и воды можно приготовить заранее в достаточных количествах и
заморозить небольшими аликвотами.
Гель-электрофорез продукта ПЦР
После завершения программы амплификации, пробы смешивают с 2,5
мкл раствора для нанесения проб и помещают в лунки горизонтального
1,5% агарозного геля, содержащего 0,5 мкг/мл бромистого этидия.
Электрофорез проводят в 1х ТВЕ-буфере в присутствии бромистого
этидия в концентрации 0,5 мкг/мл, при напряжении 30 В/см в течение
25 мин., не допуская выхода красителя бромфенолового синего из
геля.
Гель просматривают в Уф-свете и результат фоторегистрируют.
Амплифицированные фрагменты идентифицируют по размеру, сравнивая
флюоресцирующие при 254 - 302 нм в геле полосы анализируемых проб,
с полосой положительного контроля. Положительными могут считаться
только те пробы, амплифицированные фрагменты которых
(флюоресцирующие полоски в геле) находятся строго на уровне
фрагмента положительного контроля.
Данный метод детекции бруцелл, с используемыми праймерами и
представленными температурно-временными параметрами, позволяет
обнаруживать единичные клетки в пробе за 50 циклов амплификации у
всех представителей рода Brucella, что выражается флюоресцирующей
полосой в геле агарозы, размером 269 пар нуклеотидов.
Примечание. Бромистый этидий является сильным мутагеном,
поэтому все работы, связанные с перемещением агарозного геля,
проводите в перчатках.
|
