МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ДЕПАРТАМЕНТ ГОСУДАРСТВЕННОГО КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА,
ЭФФЕКТИВНОСТИ, БЕЗОПАСНОСТИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ И
МЕДИЦИНСКОЙ ТЕХНИКИ
ПИСЬМО
29 октября 2001 г.
N 291-22/144
Департамент государственного контроля качества, эффективности,
безопасности лекарственных средств и медицинской техники
направляет к сведению и руководству изменение N 2 к статье
Государственной фармакопеи XI издания "Методы микробиологического
контроля лекарственных средств" (ГФХI, вып. 2, с. 187) и просит
предусмотреть с 1 января 2002 года разделы "Микробиологическая
чистота" и "Стерильность" в стандартах качества лекарственных
средств, направляемых на регистрацию (перерегистрацию), в
соответствии с указанным изменением.
Приложение: Изменение N 2 к статье Государственной фармакопеи
XI издания "Методы микробиологического контроля
лекарственных средств" (ГФХI, вып. 2, с. 187) - на
14 л.
Заместитель руководителя Департамента
Д.В.РЕЙХАРТ
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ФАРМАКОПЕЙНЫЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ
УТВЕРЖДАЮ
Заместитель руководителя Департамента
государственного контроля качества,
эффективности, безопасности
лекарственных средств и
медицинской техники
Д.В.РЕЙХАРТ
ИЗМЕНЕНИЕ N 2
к статье Госфармакопеи XI издания
"Методы микробиологического контроля
лекарственных средств" (ГФХI, вып. 2, с. 187)
Срок введения Изменения с 01.01.2002 г.
РАЗДЕЛ 1
ТРЕБОВАНИЯ, ПРЕДЪЯВЛЯЕМЫЕ К МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ
ЧИСТОТЕ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ, СУБСТАНЦИЙ
И ВСПОМОГАТЕЛЬНЫХ МАТЕРИАЛОВ
Таблица 1
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ЧИСТОТА ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ
-----------T---------------------------T-------------------------¬
¦ Категория¦ Применение ¦ Рекомендуемые нормы для ¦
¦ ¦ ¦Госфармакопеи XII издания¦
+----------+---------------------------+-------------------------+
¦ 1 ¦ 2 ¦ 3 ¦
+----------+---------------------------+-------------------------+
¦ 1. ¦- Для парентерального ¦ Стерильность ¦
¦ ¦ введения ¦ ¦
¦ ¦- Глазные лекарственные ¦ ¦
¦ ¦ средства ¦ ¦
¦ ¦- Для нанесения на открытые¦ ¦
¦ ¦ раны и ожоги ¦ ¦
¦ ¦- Другие лекарственные ¦ ¦
¦ ¦ средства, к которым ¦ ¦
¦ ¦ предъявляется требование ¦ ¦
¦ ¦ "стерильность" ¦ ¦
+----------+---------------------------+-------------------------+
¦ 2. ¦- Для применения местно, ¦- Общее число аэробных ¦
¦ ¦ трансдермально ¦ бактерий и грибов ¦
¦ ¦- Для применения ¦ (суммарно) - не более ¦
¦ ¦ интравагинально ¦ 2 ¦
¦ ¦- Для введения в полости ¦ 10 в 1 г или в 1 мл ¦
¦ ¦ уха, носа ¦- Отсутствие бактерий ¦
¦ ¦- Для введения в ¦ семейства ¦
¦ ¦ дыхательные пути (за ¦ Enterobacteriaceae в 1 ¦
¦ ¦ исключением тех ¦ г или в 1 мл ¦
¦ ¦ лекарственных средств, ¦- Отсутствие Pseudomonas ¦
¦ ¦ которые должны ¦ aeruginosa в 1 г или в ¦
¦ ¦ быть стерильными) ¦ 1 мл ¦
¦ ¦ ¦- Отсутствие ¦
¦ ¦ ¦ Staphylococcus aureus в¦
¦ ¦ ¦ 1 г или в 1 мл ¦
+----------+---------------------------+-------------------------+
¦ 3. ¦Для приема внутрь или ¦- Общее число аэробных ¦
¦ ¦введения ректально ¦ 3 ¦
¦ ¦А. Лекарственные средства ¦ бактерий не более 10 в¦
¦ ¦из субстанций ¦ 1 г или в 1 мл ¦
¦ ¦синтетического ¦- Общее число грибов - не¦
¦ ¦происхождения ¦ 2 ¦
¦ ¦ ¦ более 10 в 1 г или в 1¦
¦ ¦ ¦ мл ¦
¦ ¦ ¦- Отсутствие Escherichia ¦
¦ ¦ ¦ coli в 1 г или в 1 мл ¦
¦ +---------------------------+-------------------------+
¦ ¦Б. Лекарственные средства ¦- Общее число аэробных ¦
¦ ¦из субстанций природного ¦ 4 ¦
¦ ¦происхождения ¦ бактерий не более 10 в¦
¦ ¦(растительного, животного ¦ 1 г или в 1 мл ¦
¦ ¦или минерального), за ¦- Общее, число грибов - ¦
¦ ¦исключением лекарственных ¦ 2 ¦
¦ ¦средств, включенных в ¦ не более 10 в 1 г или¦
¦ ¦Категорию 4 ¦ в 1 мл ¦
¦ ¦ ¦- Отсутствие Escherichia ¦
¦ ¦ ¦ coli в 1 г или в 1 мл ¦
¦ ¦ ¦- Отсутствие Salmonella в¦
¦ ¦ ¦ 10 г или в 10 мл ¦
¦ ¦ ¦- Отсутствие Pseudomonas ¦
¦ ¦ ¦ aeruginosa в 1 г или в ¦
¦ ¦ ¦ 1 мл ¦
¦ ¦ ¦- Отсутствие ¦
¦ ¦ ¦ Staphylococcus aureus в¦
¦ ¦ ¦ 1 г или в 1 мл ¦
¦ ¦ ¦- Энтеробактерий - не ¦
¦ ¦ ¦ 2 ¦
¦ ¦ ¦ более 10 в 1 г или в ¦
¦ ¦ ¦ 1 мл ¦
¦ +---------------------------+-------------------------+
¦ ¦В. Детские лекарственные ¦- Общее число аэробных ¦
¦ ¦средства ¦ бактерий не более 500 в¦
¦ ¦ ¦ 1 г или в 1 мл ¦
¦ ¦ ¦- Общее число грибов - не¦
¦ ¦ ¦ более 50 в 1 г или в 1 ¦
¦ ¦ ¦ мл ¦
¦ ¦ ¦- Отсутствие бактерий ¦
¦ ¦ ¦ семейства ¦
¦ ¦ ¦ Enterobacteriaceae в 1 ¦
¦ ¦ ¦ г или в 1 мл ¦
¦ ¦ ¦- Отсутствие Pseudomonas ¦
¦ ¦ ¦ aeruginosa в 1 г или в ¦
¦ ¦ ¦ 1 мл ¦
¦ ¦ ¦- Отсутствие ¦
¦ ¦ ¦ Staphylococcus aureus в¦
¦ ¦ ¦ 1 г или в 1 мл ¦
+----------+---------------------------+-------------------------+
¦ 4. ¦Лекарственные средства, ¦ ¦
¦ ¦состоящие из одного вида ¦ ¦
¦ ¦сырья (фасованная ¦ ¦
¦ ¦продукция) или нескольких ¦ ¦
¦ ¦(сборы), а также ¦ ¦
¦ ¦растительное сырье ¦ ¦
¦ ¦"ангро" ¦ ¦
¦ ¦А. Лекарственные ¦- Общее число аэробных ¦
¦ ¦растительные средства или ¦ 7 ¦
¦ ¦лекарственное сырье ¦ бактерий не более 10 ¦
¦ ¦"ангро", применяемые в ¦ в 1 г или в 1 мл ¦
¦ ¦виде настоев и отваров, ¦- Общее число грибов - не¦
¦ ¦приготовленные с ¦ 5 ¦
¦ ¦использованием ¦ более 10 в 1 г или в ¦
¦ ¦термической обработки ¦ 1 мл ¦
¦ ¦ ¦- Escherichia coli - не ¦
¦ ¦ ¦ 2 ¦
¦ ¦ ¦ более 10 в 1 г или в ¦
¦ ¦ ¦ 1 мл ¦
¦ +---------------------------+-------------------------+
¦ ¦Б. Лекарственные ¦- Общее число аэробных ¦
¦ ¦растительные средства ¦ 5 ¦
¦ ¦или растительное сырье ¦ бактерий не более 10 ¦
¦ ¦"ангро", применяемые без ¦ в 1 г или в 1 мл ¦
¦ ¦термической обработки ¦- Общее число грибов - не¦
¦ ¦ ¦ 4 ¦
¦ ¦ ¦ более 10 в 1 г или в ¦
¦ ¦ ¦ 1 мл ¦
¦ ¦ ¦- Отсутствие Escherichia ¦
¦ ¦ ¦ coli - в 1 г или в 1 мл¦
¦ ¦ ¦- Отсутствие Salmonella в¦
¦ ¦ ¦ 10 г или в 10 мл ¦
¦ ¦ ¦- Энтеробактерий - не ¦
¦ ¦ ¦ 3 ¦
¦ ¦ ¦ более 10 в 1 г или в ¦
¦ ¦ ¦ 1 мл ¦
L----------+---------------------------+--------------------------
Таблица 2
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ЧИСТОТА
СУБСТАНЦИЙ И ВСПОМОГАТЕЛЬНЫХ МАТЕРИАЛОВ
ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ
-----------T---------------------------T-------------------------¬
¦ Категория¦ Применение ¦ Рекомендуемые нормы для ¦
¦ ¦ ¦Госфармакопеи XII издания¦
+----------+---------------------------+-------------------------+
¦ 1 ¦ 2 ¦ 3 ¦
+----------+---------------------------+-------------------------+
¦1.2. ¦Субстанции для ¦ ¦
¦ ¦производства: ¦ ¦
¦ ¦- Стерильных ¦- Общее число аэробных ¦
¦ ¦ лекарственных, средств ¦ бактерий и грибов ¦
¦ ¦ ¦ (суммарно) ¦
¦ ¦- Нестерильных ¦ 2 ¦
¦ ¦ лекарственных средств, ¦ не более 10 в 1 г или ¦
¦ ¦ относящихся к Категории 2¦ в 1 мл ¦
¦ ¦ ¦- Отсутствие бактерий ¦
¦ ¦ ¦ семейства ¦
¦ ¦ ¦ Enterobacteriaceae в ¦
¦ ¦ ¦ 1 г или в 1 мл ¦
¦ ¦ ¦ ¦
¦ ¦- Нестерильных ¦- Отсутствие Pseudomonas ¦
¦ ¦ лекарственных средств, ¦ aeruginosa в 1 г или в ¦
¦ ¦ относящихся к Категории ¦ 1 мл ¦
¦ ¦ 3 В ¦- Отсутствие ¦
¦ ¦ ¦ Staphylococcus ¦
¦ ¦ ¦ aureus в 1 г или в 1 мл¦
+----------+---------------------------+-------------------------+
¦2.2. ¦Субстанции синтетического ¦- Общее число аэробных ¦
¦ ¦происхождения для ¦ 3 ¦
¦ ¦производства нестерильных ¦ бактерий не более 10 в¦
¦ ¦лекарственных средств ¦ 1 г или в 1 мл ¦
¦ ¦ ¦- Общее число грибов - не¦
¦ ¦ ¦ 2 ¦
¦ ¦ ¦ более 10 в 1 г или в 1¦
¦ ¦ ¦ мл ¦
¦ ¦ ¦- Отсутствие Escherichia ¦
¦ ¦ ¦ coli - в 1 г или в 1 мл¦
+----------+---------------------------+-------------------------+
¦3.2. ¦Субстанции природного ¦- Общее число аэробных ¦
¦ ¦происхождения ¦ 4 ¦
¦ ¦(растительного, животного ¦ бактерий не более 10 в¦
¦ ¦или минерального) ¦ 1 г или в 1 мл ¦
¦ ¦ ¦- Общее число грибов - не¦
¦ ¦ ¦ 2 ¦
¦ ¦ ¦ более 10 в 1 г или в ¦
¦ ¦ ¦ 1 мл ¦
¦ ¦ ¦- Отсутствие Escherichia ¦
¦ ¦ ¦ coli - в 1 г или в 1 мл¦
¦ ¦ ¦- Отсутствие Salmonella в¦
¦ ¦ ¦ 10 г или в 10 мл ¦
¦ ¦ ¦- Отсутствие Pseudomonas ¦
¦ ¦ ¦ aeruginosa в 1 г или в ¦
¦ ¦ ¦ 1 мл ¦
¦ ¦ ¦- Отсутствие ¦
¦ ¦ ¦ Staphylococcus aureus ¦
¦ ¦ ¦ в 1 г или в 1 мл ¦
¦ ¦ ¦- Энтеробактерий - не ¦
¦ ¦ ¦ 2 ¦
¦ ¦ ¦ более 10 в 1 г или в ¦
¦ ¦ ¦ 1 мл ¦
+----------+---------------------------+-------------------------+
¦4.2. ¦Вспомогательные материалы ¦- Общее число аэробных ¦
¦ ¦(мука пшеничная, крахмал, ¦ 3 ¦
¦ ¦тальк и т.д.) ¦ бактерий не более 10 в ¦
¦ ¦ ¦ 1 г или в 1 мл ¦
¦ ¦ ¦- Общее число грибов - не¦
¦ ¦ ¦ 2 ¦
¦ ¦ ¦ более 10 в 1 г или в ¦
¦ ¦ ¦ 1 мл ¦
¦ ¦ ¦- Отсутствие ¦
¦ ¦ ¦ Escherichia coli - в ¦
¦ ¦ ¦ 1 г или в 1 мл ¦
¦ ¦ ¦- Отсутствие Salmonella в¦
¦ ¦ ¦ 10 г или в 10 мл ¦
¦ ¦ ¦- Отсутствие Pseudomonas ¦
¦ ¦ ¦ aeruginosa в 1 г или в ¦
¦ ¦ ¦ 1 мл ¦
¦ ¦ ¦- Отсутствие ¦
¦ ¦ ¦ Staphylococcus aureus в¦
¦ ¦ ¦ 1 г или в 1 мл ¦
¦ ¦ ¦- Энтеробактерий - не ¦
¦ ¦ ¦ 2 ¦
¦ ¦ ¦ более 10 в 1 г или в ¦
¦ ¦ ¦ 1 мл ¦
L----------+---------------------------+--------------------------
Примечания к таблицам 1 и 2:
- В фармакопейных статьях предприятия (ФСП) могут быть указаны
в виде исключения и другие нормативы
- При обнаружении других патогенных бактерий, кроме указанных
выше, считают, что качество лекарственных средств, субстанций и
вспомогательного материала не соответствует требованиям по
показателю "Микробиологическая чистота"
РАЗДЕЛ 2
ИСПЫТАНИЕ НА Enterobacteriaceae
Дополнение к разделу: "Выявление и идентификация семейства
Enterobacteriaceae" общей ФС "Испытание на микробиологическую
чистоту" ГФXI издания, выпуск 2, стр. 197-198.
2.1. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ
ЗА ИСКЛЮЧЕНИЕМ Escherichia coli и Salmonella
10 г или 10 мл испытуемого образца помещают в 100 мл среды
N 11, гомогенизируют и инкубируют при температуре 32.5 +/- 2.5
град. C в течение, как правило, двух часов, но не более пяти. В
случае, если лекарственное средство - суппозитории или растворы в
маслах, в среду N 11 добавляют стерильный Твин-80 в количестве не
более 5% и стеклянные бусы для эмульгирования.
Гомогенат перемешивают и готовят разведения 1:10 и 1:100,
используя для этого среду N 3. В три пробирки с 10 мл среды N 3
вносят 1 мл гомогената в первую, 1 мл разведения 1:10 во вторую и
1 мл разведения 1:100 в третью, то есть соответственно 0.1 г, 0.01
г, 0.001 г образца. Посевы инкубируют при температуре (32.5 +/-
2.5) град. С в течение 24-48 ч. При наличии роста делают пересев
петлей на плотную среду N 4 (агар Эндо) и инкубируют чашки Петри
при той же температуре в течение 18-24 ч. В случае появления
характерных для Enterobacteriaceae колоний грамотрицательных
палочек определяют количество энтеробактерий в 1 г или в 1 мл
образца по Таблице 3.
Таблица 3
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ
-------------------------------------------T---------------------¬
¦ Количество испытуемого образца ¦Вероятное количество ¦
¦ ¦бактерий в 1 г (мл) ¦
+----------T---------------T---------------+---------------------+
¦0.1 г (мл)¦ 0.01 г (мл) ¦ 0.001 г (мл) ¦ ¦
+----------+---------------+---------------+---------------------+
¦ 1 мл ¦1 мл гомогената¦1 мл гомогената¦ ¦
¦гомогената¦ в разведении ¦ в разведении ¦ ¦
¦ ¦ 1:10 ¦ 1:100 ¦ ¦
+----------+---------------+---------------+---------------------+
¦ + ¦ + ¦ + ¦ Более 1000 ¦
+----------+---------------+---------------+---------------------+
¦ + ¦ + ¦ - ¦ От 100 до 1000 ¦
+----------+---------------+---------------+---------------------+
¦ + ¦ - ¦ - ¦ От 10 до 100 ¦
+----------+---------------+---------------+---------------------+
¦ - ¦ - ¦ - ¦ Менее 10 ¦
L----------+---------------+---------------+----------------------
Обозначения: + - наличие роста бактерий
- - отсутствие роста бактерий
Количество клеток E.coli в 1 г (мл) исследуемого
лекарственного средства определяют, пользуясь также данной
таблицей.
2.2. ИСПЫТАНИЕ НА НАЛИЧИЕ Escherichia coli и Salmonella
10 г (мл) образца лекарственного средства вносят в 100 мл
питательной среды N 11 (лактозный бульон). В случае, если
лекарственное средство - жидкость, количество среды уменьшают до
90 мл. Инкубируют при температуре (32.5+2.5) град. С в течение 2-5
ч. 10 мл среды N 11 переносят в 100 мл среды N 3, перемешивают и
инкубируют при температуре (32.5 +/- 2.5) град. С в течение 18-24
ч. При отсутствии роста на среде N 3 (среда прозрачная, цвет не
изменился) считают, что в лекарственном средстве не содержатся
бактерии сем. Enterobacteriaceae. При наличии роста испытания
продолжают.
2.2.1. ИСПЫТАНИЕ НА E.coli
Со среды N 3 делают пересев петлей на среду N 4 (агар Эндо) и
инкубируют при температуре (32.5 +/- 2.5) град. C в течение 18-24
ч. На среде N 4 E.coli образуют, как правило, характерные
малиновые колонии с металлическим блеском или без него, диаметром
2-4 мм. Подозрительные на принадлежность к E.coli колонии
микроскопируют. При обнаружении в мазках грамотрицательных палочек
отсевают на скошенную в пробирках среду N 1 и инкубируют при
температуре (32,5 +/- 2.5 ) град. С в течение 18-24 ч. Из пробирок
с чистой культурой делают пересевы на среды N 14 (агар Симмонса) и
N 15 (бульон Хоттингера), а также используют для теста на
цитохромоксидазу. Через 18-24 ч инкубации при (32,5 +/- 2.5) град.
С отмечают бактериальный рост или его отсутствие на средах N 14 и
N 15. Утилизацию цитрата устанавливают по изменению цвета среды
N 14 из зеленого в синий. Наличие индола определяют по появлению
красного кольца на поверхности среды N 15 при добавлении реактива
Ковача или Эрлиха.
Если в образце обнаружены грамотрицательные неспорообразующие
палочки, не обладающие ферментом цитохромоксидаза, не
утилизирующие цитрат натрия и образующие индол, считают, что
лекарственное средство контаминировано Escherichia coli.
2.2.2. ИСПЫТАНИЕ НА ВИДЫ Salmonella
1 мл обогащенной культуры на среде N 3 вносят в пробирку с 10
мл среды N 12 (селенитовая среда) и инкубируют при (32,5 +/- 2,5)
град. С в течение 16-18 ч. Делают пересев петлей на среду N 5
(висмут - сульфит агар) и инкубируют при температуре (32,5 +/-
2.5) град. С в течение 24-48 часов. На среде N 5 Salmonella
образует, как правило, типичные черные колонии с характерным
металлическим блеском, при этом участок среды под колонией
прокрашивается в черный цвет. Подозрительные на принадлежность к
Salmonella колонии микроскопируют и при обнаружении в мазках
грамотрицательных палочек отсевают на среду N 13 (трехсахарный
агар с солями железа), нанося большое количество культуры петлей
сначала на скошенную часть агара, а потом уколом в столбик.
Параллельно ставят тест на цитохромоксидазу, используя чистую
культуру со среды N 1. Через 18-24 часа инкубации при (32,5 +/-
2.5) град. С отмечают изменение цвета среды из красного в желтый
только в столбике питательной среды. Почернение среды
свидетельствует об образовании сероводорода - типичном признаке
видов Salmonella.
Если в образце обнаружены грамотрицательные неспорообразующие
палочки, не обладающие ферментом цитохромоксидаза,не
ферментирующие сахарозу и лактозу и выделяющие сероводород ,
считают, что лекарственное средство контаминировано Salmonella.
2.3. ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ <*> И РЕАКТИВЫ
1. Среда N 11 (лактозный бульон) - для предварительного
обогащения энтеробактерий
Состав:
Пептон ферментативный сухой - 8 г
Лактоза - 5 г
Вода дистиллированная - 1000 мл
______________________________________________________________
рН после стерилизации 6,9 +/- 0,1
2. Среда N 12 (селенитовая среда сухая) - для накопления и
выделения сальмонелл.
Готовят согласно прописи на этикетке.
3. Среда N 13 (трехсахарный агар с солями железа) - для
выявления сероводорода
Состав:
Мясной экстракт - 3 г
Дрожжевой экстракт - 3 г
Пептон - 20 г
Лактоза - 10 г
Сахароза - 10 г
Глюкоза - 1 г
Железа сульфат - 0,2 г
Натрия хлорид - 5 г
Натрия тиосульфат - 0,3 г
Феноловый красный - 0,024 г
Агар - 15 г
Вода дистиллированная - 1000 мл
______________________________________________________________
Рн после стерилизации 7.3 +/- 0.2. Разливают в пробирки по 5-7
мл. Стерилизуют при 121 град. С 15 мин. При охлаждении скашивают,
оставляя столбик 2-2,5 см.
4. Среда N 14 (цитратный агар Симмонса)
Состав:
Натрия хлорид - 5 г
Магния сульфат - 0,2 г
Аммония дигидрофосфат - 1 г
Калия гидрофосфат - 1 г
Натрия цитрат - 3 г
Бромтимоловый синий - 0,08 г
Агар - 20 г
Вода дистиллированная - 1000 мл
______________________________________________________________
рН после стерилизации 7,2 +/- 0.1
Приготовление: агар расплавляют при нагревании в
свежеприготовленной дистиллированной воде. Все соли сначала
растворяют в небольшом объеме воды, затем раствор добавляют к
расплавленному агару и доводят водой до 1000 мл. Устанавливают рН,
добавляют индикатор в виде 0,2% водного раствора в объеме 40 мл,
хорошо перемешивают и разливают в пробирки по 5-7 мл. Стерилизуют
при 121 град. С 15 мин. При охлаждении скашивают, оставляя столбик
2-2,5 см.
5. Среда N 15 (бульон Хоттингера) - для определения индола.
Примечание: <*> - для испытания на микробиологическую чистоту
можно использовать аналогичные сухие питательные среды
отечественных и зарубежных производителей после их валидации.
Тест на индол
В пробирку со средой N 15, в которой выросла исследуемая
культура, вносят 0,5 мл реактива Ковача или Эрлиха и слегка
встряхивают. При наличии индола наблюдают появление красного
кольца на поверхности среды в пробирке.
Реактив Ковача:
Спирт амиловый или изоамиловый - 75 мл
Пара - диметиламинобензальдегид - 5 г
Кислота хлористоводородная, конц. - 20 мл
Навеску альдегида растворяют в спирте при легком нагревании (в
водяной бане при 50-55 град. С), остужают и медленно добавляют
кислоту. Раствор хранят в защищенном от света месте. Реактив
должен быть желтого цвета.
Реактив Эрлиха:
Спирт этиловый 96% - 95 мл
Пара - диметиламинобензальдегид - 1 г
Кислота хлористоводородная, конц. - 20 мл
Навеску альдегида растворяют в спирте и медленно добавляют
кислоту. Раствор хранят в защищенном от света месте.
РАЗДЕЛ 3
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИМИКРОБНОГО ДЕЙСТВИЯ
НЕСТЕРИЛЬНЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ
Лекарственные средства, обладающие антимикробным действием,
могут подавлять рост отдельных видов бактерий и грибов. Если
исследуемое лекарственное средство оказывает ингибирующее действие
на микроорганизмы, которые выявляют в нестерильных лекарственных
средствах, необходимо адекватно инактивировать его во избежание
неправильной оценки результатов испытания на микробиологическую
чистоту. Определение антимикробного действия нестерильных
лекарственных средств проводят с использованием тест -
микроорганизмов, полученных из Государственных коллекций.
3.1. ПОДГОТОВКА ТЕСТ - ШТАММОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ
АНТИМИКРОБНОГО ДЕЙСТВИЯ НЕСТЕРИЛЬНЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ
СРЕДСТВ
1. Тест - микроорганизмы
1 2
Bacillus cereus ATCC 10702 (NCTC 8035)
Escherichia coli ATCC 25922
4
Pseudomonas aeruginosa ГИСК 453
3
Staphylococcus aureus ATCC 6538-P(FDA 209-P)
Candida albicans ATCC 885-653
5
Aspergillus niger BKM F-1119
______________________________________________________________
1
ATCC - Американская коллекция типовых культур
2
NCTC - Национальная коллекция типовых культур, Великобритания
3
FDA - Управление по контролю качества пищевых продуктов и
лекарственных средств, США
4
ГИСК - Всероссийский музей патогенных бактерий (ГИСК им. Л.А.
Тарасевича), Россия
5
BKM - Всероссийская коллекция микроорганизмов РАН, Россия
Тест - штаммы В. cereus, E. coli, P. aeruginosa, S. aureus
получают из Государственной Коллекции патогенных микроорганизмов
ГИСК им. Л.А.Тарасевича. Штамм C.albicans получают из Российского
Микологического Центра (г. Санкт - Петербург), штамм A.niger - из
ВКМ - Всероссийской Коллекции микроорганизмов РАН (г. Москва).
Культуры тест - микроорганизмов могут быть получены также из ВКПМ
- Всероссийской Коллекции промышленных микроорганизмов.
Используемые тест - штаммы должны быть типичными по культурально -
морфологическим и биохимическим свойствам.
Тест - штаммы бактерий хранят при температуре (5 +/- 1) град.
С в лиофилизированном состоянии или под слоем стерильного
вазелинового масла на среде Романова следующего состава:
Панкреатический гидролизат казеина 8.0 г
Натрия хлорид 5.0 г
Агар 10.0 г
Вода дистиллированная 1000.0 г
______________________________________________________________
рН после стерилизации 7.1 +/- 0.1
Тест - культуру C.albicans хранят под слоем вазелинового масла
на среде N 2 (агар Сабуро), в которой количество агара уменьшено
до 1%. Тест - культуру A.niger хранят на среде N 2 (агар Сабуро)
(Госфармакопея, вып. 2, с. 200), делая пересевы через каждые 3
месяца. Лиофилизированную культуру тест - штамма из ампулы или
культуру со среды хранения переносят в пробирки с питательным
бульоном: среда N 8 для бактерий, жидкая среда Сабуро - для
C.albicans. Посевы на среде N 8 инкубируют при температуре (32.5
+/- 2.5) град. С в течении 18-24 ч, посевы на жидкой среде
Сабуро - при температуре (22.5 +/- 2.5) град. С в течение 48 ч -
для C.albicans. Посевы A.niger на среде N 2 инкубируют при
температуре (22.5 +/- 2.5) град. С до появления черных или
темнокоричневых экзогенных спор (конидий) в течении 5-7 сут.
Перед определением антимикробного действия нестерильных
лекарственных средств культуры тест - штаммов бактерий отсевают на
среду N 8 (питательный бульон) и инкубируют при температуре
(32.5 +/- 2.5) град. С в течение 18-24 ч.
Культуры грибов выращивают заранее: C.albicans - на жидкой
среде Сабуро за 48 ч, а A.niger - на среде N 2 за 5-7 сут до
начала определения.
3.2. ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ И РАСТВОРЫ
(Государственная фармакопея XI издания,
выпуск 2, с. 193, 201, 208-209)
Среда N 8 - для выращивания бактерий.
Жидкая среда Сабуро - для выращивания Candida albicans.
Среда N 2 (агар Сабуро) - для выращивания Aspergillus niger.
Среды NN 3-5 - для идентификации бактерий
семейства Enterobacteriaceae.
Среда N 9 - для идентификации Pseudomonas
aeruginosa.
Среда N 10 - для идентификации Staphylococcus
aureus.
Фосфатный буферный раствор с натрия хлоридом и пептоном, рН
7.0
3.3. ПРОВЕДЕНИЕ ИСПЫТАНИЯ
Готовят разведения лекарственного средства 1:10, 1:20, 1:50,
1:100, 1:200, 1:500, используя фосфатный буферный раствор (для
приготовления эмульсий в раствор добавляют не более 5% Твина-80).
Бульонные культуры бактерий и C.albicans разводят фосфатным
буферным раствором не менее, чем 1:1000. Культуру A.niger смывают
со скошенного агара фосфатным буферным раствором с 0.05% Твина-80.
Определяют количество конидий в 1 мл смыва, используя камеру
Горяева или чашечный агаровый метод, и разводят до концентрации
3 4
10 - 10 КОЕ/мл.
Испытание проводят представленными в 3.3.1. и 3.3.2. методами
определения антимикробного действия.
3.3.1. МОДИФИКАЦИЯ МЕТОДА ГОСФАРМАКОПЕИ XI
Каждое разведение лекарственного средства вносят по 1 мл в
чашки Петри диаметром 90 мм, в одни из которых добавляют по 0.2 мл
взвеси культуры B.cereus, a в оставшиеся - по 0.2 мл культуры
C.albicans и A.niger. В чашки с B.cereus вносят по 7-10 мл
расплавленной среды N 1 при температуре (47.5 +/- 2.5) град. С, в
чашки с культурами C.albicans и A.niger - то же количество среды
N 2.
Каждое разведение лекарственного средства вносят по 1 мл в
пробирки с 10 мл жидкой среды - N 3 и N 8. В пробирки со средой
N 3 добавляют по 1 мл взвеси культуры E.coli, в пробирки со средой
N 8 - по 1 мл взвеси культур P.aeruginosa и S.aureus, каждую
отдельно. В контрольные чашки и пробирки вместо разведений
лекарственного средства вносят такое же количество буферного
раствора.
Посевы на средах N 1, 3, 8 инкубируют при температуре (32.5
+/- 2.5) град. С в течение 2 сут (среды N 3, 8) и 5 сут ( среда N
1). Посевы на среде N 2 инкубируют при температуре (22.5 +/-2.5)
град. C в течение 5 сут. В случае, если при внесении
лекарственного средства в жидкие питательные среды (N 3, N 8)
образуется помутнение, препятствующее учету результатов, делают
пересев со среды N 3 на среду N 4 (агар Эндо), а со среды N 8 - на
среды N 9 и N 10. При росте типичных колоний E.coli (среда N 4),
P.aeruginosa (среда N 9) и S.aureus (среда N 10) отмечают наличие
роста тест - микроорганизма.
3.3.2. МЕТОД РЕПЛИКАЦИЙ (для водонерастворимых лекарственных
средств). В стерильные чашки Петри вносят по 1 мл каждого
разведения исследуемого лекарственного средства. В контрольные
чашки вносят по 1 мл растворителя, который используют для
получения разведения. В чашки Петри (как в эксперименте, так и в
контроле) добавляют по 15-20 мл расплавленной и охлажденной до
(47.5 +/- 2,5) град. С среды N 1, в другие - такое же количество
среды N 2 и быстро перемешивают. После застывания агара чашки
подсушивают для удаления конденсата с поверхности среды.
На поверхность агара бактериологической петлей или
репликатором наносят бляшками инокулят каждого тест - штамма
бактерий и грибов на среды N 1 и N 2 соответственно.
Чашки со средой N 1 инкубируют при температуре (32.5 +/- 2.5)
град. С в течение 48 ч. Чашки со средой N 2 инкубируют при
температуре (22.5 +/- 2.5) град. С в течение - 3-5 сут.
Учет результатов. После окончания сроков инкубации посевов
(появление типичного роста тест - микроорганизмов в контрольных
чашках без лекарственного средства) отмечают наличие или
отсутствие роста тест - штаммов бактерий и грибов на средах, в
которые вносили различные разведения лекарственного средства.
Наличие такого же роста тест - микроорганизма, как в контроле,
обозначают знаком "+", отсутствие роста - знаком "-", слабый или
замедленный рост - знаком "+/-".
Отсутствие роста тест - микроорганизма на среде с препаратом
свидетельствует о том, что исследуемый препарат в данном
разведении обладает антимикробным действием в отношении
определенного тест - микроорганизма.
3.3.3. НЕЙТРАЛИЗАЦИЯ АНТИМИКРОБНОГО ДЕЙСТВИЯ
Для устранения антимикробного действия лекарственного средства
используют различные методы: - 1) увеличивают разведение
лекарственного средства, 2) добавляют необходимое количество
соответствующего специфического инактиватора, нейтрализующего
антимикробное действие лекарственного средства, но не угнетающего
рост микроорганизмов - контаминантов (например, бета - лактамазу -
для пенициллинов и цефалоспоринов, пара - аминобензойную кислоту -
для сульфаниламидов), 3) применяют неспецифический инактиватор
следующего состава, используемого в качестве растворителя:
Твин-80 - 30 г
Лецитин яичный - 3 г
L-гистидина гидрохлорид - 1 г
Пептон (мясной или казеиновый) - 1 г
Натрия хлорид - 4.3 г
Калия фосфат однозамещенный - 3.6 г
Натрия фосфат двузамещенный - 7.2 г
Воды дистиллированной - 1000.0 мл
Стерилизуют в паровом стерилизаторе насыщенным паром под
давлением при температуре 121 град. С в течение 15 мин. Если
антимикробное действие полностью не устраняется, увеличивают
концентрацию Твина-80 или лецитина.
Директор ИГКЛС НЦЭГКЛС
Минздрава России
профессор, академик МАИ
Н.С.ЕВТУШЕНКО
10 апреля 2001 г.
Председатель Государственного
Фармакопейного комитета,
профессор, чл.- корр. РАМН
А.П.АРЗАМАСЦЕВ
4 июля 2001 г.
Главный Ученый секретарь
Государственного Фармакопейного
комитета, доктор фарм. наук
В.Л.БАГИРОВА
4 июля 2001 г.
|
