Утверждаю
Председатель
Госкомсанэпиднадзора России -
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Е.Н.БЕЛЯЕВ
24 июля 1995 года
Дата введения:
с момента утверждения
4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АМАНИТИНОВ И ФАЛЛОИДИНА В СЫРЫХ ГРИБАХ
И ПРОДУКТАХ ИХ ПЕРЕРАБОТКИ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
МУК 4.1.032-95
1. Разработаны: Институтом питания РАМН (Тутельян В.А.,
Хотимченко С.А., Бессонов В.В.); Российским Республиканским
информационно-аналитическим центром Госкомсанэпиднадзора России
(Агеев В.П.); Госкомсанэпиднадзором России (Петухов А.И.).
2. Утверждены и введены в действие Председателем
Госкомсанэпиднадзора России - Главным государственным санитарным
врачом Российской Федерации Е.Н. Беляевым 24 июля 1995 г.
3. Введены впервые.
Область применения
Настоящие Методические указания устанавливают ТСХ и
ВЭЖХ/УФ-спектрофотометрические методы определения аманитинов и
фаллоидина в сырых грибах и продуктах их переработки.
Метод ТСХ предназначается для проведения рутинных и
скрининговых исследований, а метод ВЭЖХ предназначается для
проведения арбитражных анализов и подтверждения результатов
определений, полученных методом ТСХ.
Методические указания предназначены для учреждений
госсанэпиднадзора и других ведомств, осуществляющих контроль
качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых
продуктов.
1. Метод определения аманитинов и фаллоидина
тонкослойной хроматографией
1.1. Сущность метода
Анализ включает в себя пробоподготовку методом
жидкостно-жидкостной экстракции метанолом, разделения токсинов
хроматографией в тонком слое сорбента, детектировании зон
абсорбции и количественное определение содержания токсинов
визуальным методом либо с применением денситометра (отражательного
спектрофотометра).
Идентификацию токсинов осуществляют сравнением подвижностей
обнаруженных в условиях ТСХ веществ с подвижностью
соответствующего стандарта.
Нижний предел определения аманитинов и фаллоидина - 0,03 мг/кг
продукта.
1.2. Отбор проб
Навеска массой 50 - 150 г отбирается из средней пробы,
подготовленной в соответствии с действующими ГОСТами на конкретный
вид продукции. Отобранные образцы можно хранить в морозильной
камере при температуре -8 -С до 10 суток, при температуре -18 -С -
до 3-х месяцев.
1.3. Приборы и материалы
Весы технические по ГОСТу 19491-74 и весы аналитические по
ГОСТу 24104-80.
Шкаф сушильный, нагревательные приборы (электронагреватель по
ГОСТу 13268-83, колбонагреватель или электроплитка по ГОСТу
14919-83).
Ротационный испаритель с ловушкой по ТУ 25-11-917-76.
Насос водоструйный по ГОСТу 10696-75.
Денситометр фирмы "Shimadzu" или подобный.
Контактные термометры по ГОСТу 9871-75.
Весы лабораторные общего назначения по ГОСТу 24104-80 с
наибольшим пределом взвешивания до 500 г с пределом допустимой
погрешности +/- 0,038 г.
Микрошприц МШ-10 на 10 мкл или калиброванные стеклянные
капилляры.
Аппарат Сокслета.
Воронка Бюхнера по ГОСТу 9147-80.
Мясорубка или гомогенизатор по ГОСТу 15906-79.
Бумажные фильтры обеззоленные марки ФОМ по ТУ 6-09-1678-77.
Цилиндры мерные на 25, 50, 100, 200 мл по ГОСТу 1770-74.
Колбы мерные или пробирки мерные 2, 5, 25, 50 мл по ГОСТу
1770-74.
Колбы круглодонные на 1000, 500, 250, 100 и 50 мл по ТУ 48-52.
Диэтиловый эфир по ГОСТу 842006-82.
Спирт метиловый по ГОСТу 6995-77.
Хлороводородная кислота по ГОСТу 14261-77.
Уксусная кислота по ГОСТу 61-75.
Хлороформ по ГОСТу 20015-74.
Коричный альдегид.
Вода дистиллированная по ГОСТу 6709-72.
Пластинки для ТСХ.
Стандартные и рабочие растворы:
альфа-аманитин, бета-аманитин, фаллоидин - раствор в метаноле
концентрации 1 мг/мл.
1.4. Требования техники безопасности
при проведении испытаний
Помещение, в котором производится определение токсинов,
обязательно должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией.
Работу с образцами, стандартами, другими химическими
соединениями и растворителями проводить в вытяжном шкафу с
использованием индивидуальных средств защиты (очки, перчатки и
др.).
В лаборатории, где проводится работа с высокотоксичными
токсинами, необходимо всегда иметь достаточное количество
этилового спирта для детоксикации, при попадании его на рабочие
места и пол.
Транспортировка и хранение токсинов осуществляется в
стеклянных запаянных ампулах, обернутых в бумагу и упакованных в
металлическую тару.
1.5. Подготовка к испытанию
1.5.1. Приготовление стандартных растворов.
Стандартные растворы токсинов с концентрацией 1 мг/мл
используются при анализе в качестве калибровочного стандарта,
готовятся из 1 мг сухого стандарта токсина с чистотой 90%,
растворив его в 1 мл метанола для хроматографии. Срок хранения
стандартного раствора - 3 месяца при -3 -С.
1.5.2. Подготовка хроматографической пластинки.
Хроматографическую пластинку непосредственно перед анализом
промывают диэтиловым эфиром и активируют в сушильном шкафу в
течение 1 часа при температуре 110 -С.
1.5.3. Подготовка системы для ТСХ.
Разделение токсинов проводят в системе растворителей:
хлороформ - 5%-ный раствор коричного альдегида в метаноле -
уксусная кислота - вода в соотношении 77:33:5:7,5.
Систему помещают в камеру для ТСХ для предварительного ее
насыщения парами растворителей в течение 1 часа.
1.6. Выделение токсинов из навески образца
Навеску 50 - 80 г измельченных в мясорубке или гомогенизаторе
грибов помещают в аппарат Сокслета, добавляют 100 мл метанола и
регулируют нагрев таким образом, чтобы один цикл экстракции
завершался за 15 минут.
После прохождения 6 циклов метанольный экстракт сливают,
отфильтровывают, помещают в круглодонную колбу и упаривают на
ротационном испарителе при температуре не выше 60 -С досуха. Сухой
остаток перерастворяют в 2 мл метанола.
1.7. Проведение анализа в тонком слое сорбента
На линию старта хроматографической пластинки, подготовленной
по п. 1.5.2, микрошприцами наносят: 50 мкл полученного
метанольного экстракта, растворы стандартных образцов,
соответствующих 50 мкг (50 мкл стандартного раствора), 25 мкг (25
мкл стандартного раствора) и 75 мкг токсина в пятне.
Помещают хроматографическую пластинку в камеру с системой для
ТСХ, предварительно насыщенную парами растворителей, как указано в
п. 1.5.3.
По достижении линией фронта верхнего края пластинки, пластинку
вынимают, высушивают на воздухе и помещают в эксикатор, на дно
которого налита концентрированная хлороводородная кислота. При
этом зоны абсорбции визуализуются: аманитины окрашиваются в
фиолетовый цвет, фаллоидины - в розовый, сопутствующие вещества -
в желтый.
Порядок элюирования токсинов - бета-аманитин, альфа-аманитин,
фаллоидин.
Токсины считаются надежно идентифицированными, если разница
величин Rf исследуемого пятна и пятна стандартного образца не
превышает 0,04.
1.8. Количественное определение токсинов
Количественное определение проводится визуальным методом,
сравнивая величину и интенсивность пятен исследуемого вещества и
стандартного образца или с использованием денситометра
(отражательного спектрофотометра). Условия денситометрии: длина
волны 550 нм, скорость сканирования 0,5 см/сек. При использовании
денситометра необходимо проведение предварительной калибровки
прибора по стандартным образцам токсинов.
2. Спектрофотометрический метод
2.1. Сущность метода
Метод определения аманитинов и фаллоидина в сырых грибах и
продуктах их переработки основан на выделении фракции, содержащей
токсины, путем экстракции метанолом и очистки экстракта на
силикагеле; концентрировании экстракта; разделении и
количественном определении содержащихся в концентрате веществ,
поглощающих в УФ-области.
Идентификацию токсинов осуществляют сравнением времен выхода в
условиях ВЭЖХ веществ, поглощающих в УФ-области с временем выхода
соответствующего стандарта.
Нижний предел определения токсинов - 0,001 мг/кг продукта.
2.2. Отбор проб
См. раздел 1.2.
2.3. Аппаратура, материалы, реактивы
Весы аналитические по ГОСТу 24104-80.
Шкаф сушильный, нагревательные приборы (электронагреватель по
ГОСТу 13268-83, колбонагреватель или электроплитка по ГОСТу
14919-83).
Ротационный испаритель с ловушкой по ТУ 25-11-917-76.
Насос водоструйный по ГОСТу 10696-75.
Контактные термометры по ГОСТу 9871-75.
Жидкостной хроматограф "Shimadzu LC-10A" с УФ-детектором с
переменной длиной волны или подобный; колонка и предколонка с
силикагелем, химически связанным с октадецилсиланом, размер частиц
5 мкм, длина колонки 25 см, предколонки - 4,5 см, внутренний
диаметр - 4,6 мм, объем вводимой пробы 20 мкл.
Шприц для ввода образцов для жидкостного хроматографа.
Весы лабораторные общего назначения по ГОСТу 24104-80 с
наибольшим пределом взвешивания до 500 г с пределом допустимой
погрешности +/- 0,038 г.
Воронка Бюхнера по ГОСТу 9147-80.
Бумажные фильтры обеззоленные марки ФОМ по ТУ 6-09-1678-77.
Аппарат Сокслета.
Мясорубка или гомогенизатор по ГОСТу 15906-79.
Силикагель с размером частиц 40 - 100 меш.
Цилиндры мерные на 50, 100, 200 мл по ГОСТу 1770-74.
Колбы мерные или пробирки мерные 2, 5, 25, 50 мл по ГОСТу
1770-74.
Холодильник обратный по ГОСТу 23932-79 и 25336-82.
Колбы круглодонные на 1000, 500, 250, 100 и 50 мл по ТУ 48-52.
Ацетонитрил по ТУ 6-09-3534-74.
Вода дистиллированная по ГОСТу 6709-72.
Спирт метиловый по ГОСТу 6995-77.
Стандартные и рабочие растворы:
альфа-аманитин, бета-аманитин, фаллоидин - растворы в метаноле
концентрации С1 = 0,01 мг/мл.
2.4. Требования техники безопасности
при проведении испытаний
См. раздел 1.4.
2.5. Подготовка к испытанию
2.5.1. Приготовление стандартных растворов.
2.5.1.1. Содержимое ампулы стандартного раствора токсина (1
мг) растворяют в 100 мл метанола и получают стандартный образец
концентрации 0,01 мг/мл, плотно закрывают и хранят в холодильнике
при температуре -3 -С не более 3 месяцев.
2.5.1.2. Стандартный раствор токсина с концентрацией 1 мкг/мл,
используемый при анализе в качестве калибровочного стандарта,
готовят из 1 мл стандартного раствора токсина с концентрацией С =
0,01 мг/мл, перенеся его в мерную колбу на 10 мл и доведя
метанолом до метки.
Стандартные растворы хранят в темном месте в холодильнике в
посуде с пришлифованной пробкой не более 3 месяцев.
2.5.1.3. Подготовка к анализу растворителей и реактивов,
контроль их чистоты.
Метанол - перегнанный в стекле.
Ацетонитрил - перегнанный в стекле.
Контроль чистоты реактивов:
По 10 - 20 мл ацетонитрила и метанола раздельно упаривают до
объема приблизительно 1 мл и анализируют концентрат на наличие
посторонних примесей, поглощающих при 303 нм УФ-области. При
отсутствии поглощения - реагенты используются в работе, при
наличии поглощения - подвергаются дополнительной очистке путем
перегонки на ректификационной насадочной колонне или заменяются на
новую партию.
2.5.2. Подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ.
Отмеряют 200 мл ацетонитрила, прозрачного при 303 нм,
переносят в мерную колбу на 1000 мл, доводят до метки
дистиллированной водой, фильтруют, дегазируют.
2.6. Экстракция и очистка токсинов из образца
Навеску 50 - 80 г измельченных в мясорубке или гомогенизаторе
грибов помещают в аппарат Сокслета, заливают 100 мл метанола и
регулируют нагрев таким образом, чтобы один цикл экстракции
завершался за 15 мин. После прохождения 6 циклов метанольный
экстракт сливают, отфильтровывают на бумажном фильтре, на воронке
Бюхнера. На фильтр предварительно наносят слой силикагеля в виде
суспензии в метаноле с таким расчетом, чтобы получить слой
силикагеля толщиной около 5 мм. По окончании фильтрации промывают
фильтр 100 мл метанола. Полученный маточный раствор после
фильтрации переносят в мерную колбу на 500 мл, доводят до метки
метанолом и используют для анализа.
2.7. Проведение анализа
2.7.1. Условия ВЭЖХ.
Скорость подвижной фазы 1 мл/мин. Детектирование проводится
при длине волны 303 нм при 0,0025 ед. AUFS.
Примечание. При приведенных условиях хроматографирования время
выхода пика стандартных растворов:
бета-аманитин (время выхода около 2 мин.),
альфа-аманитин (время выхода 4 - 5 мин.),
фаллоидин (8,5 - 9,5 мин.).
2.7.2. Калибровка.
2.7.2.1. Вводят в петлю инжектора 20 мкл стандартного раствора
аманитина с концентрацией 1 мкг/мл, измеряют площадь полученного
пика стандартного раствора.
2.7.2.2. Повторяют по п. 2.7.2.1 дважды, последовательно введя
в хроматограф 10 мкл и 5 мкл стандартного образца.
В диапазоне концентраций 5 - 20 мкг/мл зависимость площади
пика от массы введенного токсина линейна. Строят градуировочный
график.
2.7.3. Измерение концентрации токсинов в образце.
2.7.3.1. Отбирают 20 мкл от полученного по п. 2.6 экстракта
(доведенного до 500 мл). Вводят его в хроматограф и определяют
площадь пика, совпадающего по времени выхода с пиком стандартного
раствора.
2.7.3.2. При отсутствии в введенном образце пика, совпадающего
по времени выхода с временем выхода стандартного раствора
какого-либо токсина (альфа-аманитина, бета-аманитина, фаллоидина),
от 500 мл образца отбирают аликвоту 50 мл, упаривают ее в
ротационном испарителе (не досуха) при нагреве не выше 60 -С,
остаток растворителя удаляют в слабом токе азота. Остаток
растворяют в 0,5 мл метанола, отбирают из него 20 мкл и вводят в
хроматограф.
2.7.3.3. При отсутствии пиков токсинов в упаренной аликвоте,
считается, что токсин отсутствует в образце в пределах
чувствительности метода.
2.7.4. Подтверждение наличия токсина в анализируемом образце.
2.7.4.1. При наличии пика токсина в анализируемом образце,
смешивают в шприце 10 мкл образца и 10 мкл стандартного раствора
токсина с той концентрацией (10 или 100 мкг/мл), площадь пика
которой при калибровке более близка к площади пика токсина в
образце. Вводят смешанную пробу в хроматограф. Наличие какого-либо
из токсинов в образце считается подтвержденным, если полученный в
результате совместного ввода пик аманитина не разделяется на два
пика, имеет правильную симметричную форму.
2.8. Количественное определение токсинов
Измеряют площадь пика токсина в образце (N), и проводят расчет
по приведенной формуле:
С х N х V х 100
1
К = ------------------ (мкг/кг),
S х П х V х R х %
2
где:
К - концентрация токсина в сырых грибах и продуктах их
переработки, мкг/кг;
N - площадь пика токсина в исследуемом образце, кв. см;
П - навеска продукта, кг;
V - объем анализируемой пробы, мкл;
1
V - объем введенной пробы, мкл;
2
С - концентрация токсина, введенного в хроматограф из
стандартного раствора, мкг;
S - площадь пика токсина, полученного при вводе стандартного
раствора, кв. см;
% - степень извлечения токсина из образца;
R - коэффициент, учитывающий концентрирование образца (при
концентрировании по п. 2.7.3.2 R = 100).
Статистическая обработка результатов анализа грибов и
продуктов их переработки показала, что относительное стандартное
отклонение колеблется от 20 до 30% (при n = 5, Р = 0,89).
|
