Утверждаю
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации,
Первый заместитель
Министра здравоохранения
Российской Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
24 октября 2003 года
Дата введения -
1 декабря 2003 года
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
МЕТОД МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ИЗМЕРЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ КЛЕТОК
МИКРООРГАНИЗМА TRICHODERMA VIRIDE 44-11-62/3 - ПРОДУЦЕНТА
КОМПЛЕКСА ЦЕЛЛЮЛОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ В АТМОСФЕРНОМ
ВОЗДУХЕ НАСЕЛЕННЫХ МЕСТ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
МУК 4.2.1775-03
1. Разработаны Российским государственным медицинским
университетом (к.б.н. Н.И. Шеиной).
2. Утверждены Первым заместителем министра здравоохранения
Российской Федерации - Главным государственным санитарным врачом
Российской Федерации 24 октября 2003 г.
3. Введены в действие с 1 декабря 2003 г.
4. Введены впервые.
1. Общие положения и область применения
Настоящие Методические указания устанавливают методику
проведения микробиологического количественного анализа
концентрации клеток штамма - Trichoderma viride 44-11-62/3 -
продуцента комплекса целлюлолитических ферментов (целлюлаза,
ксиланаза) в атмосферном воздухе населенных мест в диапазоне
концентраций от 100 до 5000 клеток в 1 куб. м воздуха.
Методические указания разработаны в соответствии с
требованиями ГОСТ 17.2.4.02-81 "Охрана природы. Атмосфера. Общие
требования к методам определения загрязняющих веществ" и ГОСТ Р
8.563-96 "Методики выполнения измерений".
Методические указания предназначены для применения в
лабораториях предприятий, организаций и учреждений,
аккредитованных в установленном порядке на право проведения
микробиологических исследований.
Методические указания одобрены и рекомендованы секцией
"Гигиенические аспекты биотехнологии и микробного загрязнения
окружающей среды" Проблемной комиссии "Научные основы гигиены
окружающей среды".
2. Характеристика штамма-продуцента
Trichoderma viride 44-11-62/3
На агаризованной среде сусло-агар (содержание солодового сусла
5 - 6- по Баллингу) на 5 день развития микроорганизм образует
характерные колонии до 5,0 - 5,5 см в диаметре с гладкой подошвой,
слегка приподнятые над поверхностью среды, не врастающие в агар, с
волнистым краем, пушистым воздушным мицелием, который покрыт
спорами лимонно-желтого цвета. На 3 день развития в среду
выделяется ярко-желтый пигмент лимонного оттенка. Гифы мицелия
бесцветные, септированные, многократно ветвистые.
Систематическое положение микроорганизма
Класс Fungi imperfecti
Порядок Hyphomycetales
Род Trichoderma
Вид viride
Штамм 44-11-62/3
Штамм Trichoderma viride 44-11-62/3 получен во
ВНИИбиотехнология в лаборатории Биосинтеза ферментов методом
индуцированной селекции с применением этиленимина и
нитрозометилмочевины из исходной культуры Trichoderma viride 44 -
продуцента целлюлазы и депонирован в ЦМПМ ВНИИгенетика.
Штамм-продуцент синтезирует высокоактивный комплекс
целлюлолитических ферментов для производства ферментного препарата
целловиридин Г3х. Максимальная активность целлюлазы составляет 35
ед./мл, ксиланазы - 42 ед./мл.
Штамм-продуцент растет на жидких и агаризованных средах.
Культивирование гриба происходит 5 суток при температуре 36 - 38
-С, затем 5 суток при комнатной температуре. Для размножения и
хранения используется сусло-агар 5 - 6 -Б, рН среды - 5,0 - 6,0.
Предельно допустимая концентрация (ПДК) в атмосферном воздухе
населенных мест - 200 кл./куб. м, пометка А.
3. Пределы измерений
Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток
штамма-продуцента в атмосферном воздухе в диапазоне концентраций
от 100 до 5000 клеток в 1 куб. м воздуха при доверительной
вероятности 0,95.
4. Метод измерений
Прямой метод измерения концентрации штамма-продуцента основан
на аспирации из воздуха микробных клеток (спор, фрагментов
мицелия) на поверхность плотной питательной среды сусло-агар и
подсчета выросших колоний по культурально-морфологическим
признакам на день развития.
Косвенный метод измерения концентрации штамма-продуцента
основан на аспирации из воздуха микробных клеток на поверхность
плотной питательной селективной среды и подсчета выросших колоний
по зонам просветления, образующихся вокруг каждой колонии штамма,
как результат продукции целлюлазы на среде с окрашенной
целлюлозой.
5. Средства измерений, вспомогательные устройства,
реактивы и материалы
При выполнении измерений применяют следующие средства
измерений, вспомогательные устройства и материалы.
5.1. Средства измерений,
вспомогательные устройства, материалы
Прибор для бактериологического анализа ТУ 64-12791-77
воздуха, модель 818 (щелевой прибор Кротова)
Термостаты электрические суховоздушные
или водяные
Автоклав электрический ГОСТ 9586-75
Бокс, оборудованный бактерицидными лампами
Холодильник бытовой
Весы лабораторные, аналитические типа ВЛА-200
Микроскоп биологический с иммерсионной
системой типа "Биолам" Л-211
Лупа с увеличением х10 ГОСТ 25706-83
Чашки Петри бактериологические плоскодонные,
стеклянные, диаметром 100 мм
Пробирки биологические ГОСТ 10515-75
вместимостью 20 и 35 мл
Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл ГОСТ 10515-75
Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл ГОСТ 1770-74
Колбы конические вместимостью 250 и 500 мл ГОСТ 1770-74
Секундомер ГОСТ 9586-75
Барометр ГОСТ 24696-79
Марля медицинская ГОСТ 9412-77
Вата медицинская гигроскопическая ГОСТ 25556-81
5.2. Реактивы, растворы
Агаризованное пивное сусло 5 - 6 -Б
для штамма-продуцента (агар - 1,8%, рН 5,0 - 6,0,
режим стерилизации 1,1 - 1,2 ати в течение 30 мин.)
Молочная кислота, ГОСТ 490-79
синоним - альфа-оксипропионовая
кислота (из расчета 0,4 мл на 100 мл среды
сусло-агар для подавления посторонней
бактериальной флоры)
Бенгальский розовый
Диметилсульфоксид
Спирт этиловый ректификат ГОСТ 5962-67
Селективная среда для штамма-продуцента,
состав среды: КН РО - 1 г; МgSО 7Н О - 0,5 г;
2 4 4 2
(NН ) SО - 0,7 г; целлюлоза порошковая
4 2 4
в пересчете на сухое вещество - 0,9 г; лактоза
- 0,3 г; дрожжевой экстракт - 0,5 г; агар - 18 г;
вода дистиллированная - до 1000 мл
6. Требования безопасности
При выполнении измерений концентрации клеток штамма-продуцента
в атмосферном воздухе соблюдают следующие требования:
6.1. Правила техники безопасности при работе с химическими
реактивами по ГОСТ 12.1.005-88.
6.2. Электробезопасность при работе с электроустановками по
ГОСТ 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора.
6.3. "Инструкции по устройству, требованиям безопасности и
личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях
предприятий микробиологической промышленности" (1977).
6.4. Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном
шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом
осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.
7. Требования к квалификации операторов
К выполнению измерений и обработке их результатов допускают
лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших
соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области
микробиологических исследований.
8. Условия измерений
Процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу
проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20 +/- 5
-С), атмосферном давлении 630 - 800 мм рт. ст. и влажности воздуха
не более 80%.
9. Проведение измерения
9.1. Условия отбора проб воздуха
Для определения концентрации клеток штамма-продуцента воздух
аспирируют при помощи аппарата Кротова со скоростью 10 л/мин. на
поверхность плотной питательной среды. Время аспирации воздуха (5
- 20 мин.) зависит от предполагаемой концентрации клеток
продуцента (прямой метод позволяет учитывать на чашке до 200
колоний продуцента, косвенный - до 30 - 50 колоний на чашке).
Аппарат Кротова перед каждым отбором пробы воздуха тщательно
протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность
подвижного диска и внутреннюю стенку прибора, наружную и
внутреннюю стенку крышки. На подвижной диск устанавливают
подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее
крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой
недопустимо. После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор
открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от
данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку
контроля, время аспирации и дату отбора пробы.
9.2. Выполнение анализа
При выполнении анализа воздуха прямым методом среду сусло-агар
расплавляют, остужают до 50 - 60 -С, добавляют молочной кислоты из
расчета 0,4 мл на 100 мл среды (для подавления посторонней
бактериальной микрофлоры), тщательно перемешивают и разливают в
чашки Петри.
При выполнении анализа воздуха косвенным методом селективную
среду расплавляют, остужают до 60 -С, добавляют 50 мг/л
бенгальского розового, растворенного в 1 мл диметилсульфоксида,
тщательно перемешивают и разливают по 10 мл в стеклянные чашки
Петри на горизонтальной поверхности. Бенгальский розовый
предназначен для специфического окрашивания целлюлозы и для
ограничения разрастания колоний на чашках.
Чашки с застывшей средой помещают в термостат на сутки при
температуре 37 -С, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные
чашки используют для контроля воздуха.
После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат на
42 -С (для интенсификации развития гриба). Через 3 суток
производят подсчет выросших колоний по
культурально-морфологическим признакам и характерной пигментации
среды (прямой метод) или зон просветления вокруг выросших колоний
продуцента (косвенный метод) как результат продукции
целлюлолитических ферментов на среде с окрашенной целлюлозой.
10. Вычисление результатов измерения
Расчет концентрации клеток продуцента в пересчете на 1 куб. м
воздуха производят по формуле:
N х 1000
Х = --------, кл./куб. м,
V
где:
Х - концентрация клеток продуцента в воздухе;
N - количество колоний продуцента, выросших на чашке;
1000 - коэффициент пересчета на 1 куб. м воздуха;
V - объем воздуха, л (произведение скорости на время
аспирации).
11. Оформление результатов измерений
Результаты измерений оформляют протоколом по форме.
Протокол N
количественного микробиологического анализа
штамма-продуцента Trichoderma viride 44-11-62/3
в атмосферном воздухе населенных мест
1. Дата проведения анализа _______________________________
2. Место отбора пробы ____________________________________
3. Название лаборатории __________________________________
4. Юридический адрес организации _________________________
Результаты микробиологического анализа
-----------------T----------------------T------------------------¬
¦Шифр или N пробы¦ Определяемый ¦Концентрация, кл./куб. м¦
¦ ¦ микроорганизм ¦ ¦
+----------------+----------------------+------------------------+
L----------------+----------------------+-------------------------
Ответственный исполнитель
Научный руководитель
Список литературы
1. Руководство по контролю загрязнения атмосферы: РД
52.04.186-96. М., 1991. 693 с.
2. ГОСТ Р 8.563-96. ГСИ "Методики выполнения измерений".
3. Положение об организации работы по технике безопасности в
микробиологической промышленности. М., 1980. 27 с.
4. Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной
гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий
микробиологической промышленности. М., 1977. 7 с.
5. ГОСТ 17.2.4.02-81 "Охрана природы. Атмосфера. Общие
требования к методам определения загрязняющих веществ". М.: Изд-во
стандартов, 1981. 3 с.
6. Бабьева И.П., Зенова Г.М. Биология почв. М.: МГУ. 122 с.
|