Утверждаю
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации,
Первый заместитель
Министра здравоохранения
Российской Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
20 сентября 2001 года
Дата введения:
с момента утверждения
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
МЕТОД МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ИЗМЕРЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ КЛЕТОК
ШТАММА-ПРОДУЦЕНТА ТИЛОЗИНА STREPTOMYCES FRADIAE БС-1
В ВОЗДУХЕ РАБОЧЕЙ ЗОНЫ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
МУК 4.2.1068-01
1. Разработаны д.м.н. Ивановым Н.Г., к.б.н. Шенной Н.И.
(Российский государственный медицинский университет).
2. Утверждены и введены в действие Главным государственным
санитарным врачом Российской Федерации - Первым заместителем
Министра здравоохранения Российской Федерации 20 сентября 2001 г.
3. Введены впервые.
1. Общие положения и область применения
Настоящие методические указания устанавливают методику
проведения микробиологического количественного анализа
концентрации клеток штамма-продуцента тилозина Streptomyces
fradiae БС-1 в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от
100 до 50000 клеток в 1 куб. м воздуха.
Методические указания разработаны с целью обеспечения
микробиологического контроля штамма Streptomyces fradiae БС-1 в
воздухе производственных помещений биотехнологических производств
и оценки соответствия уровня его содержания гигиеническим
нормативам на основе учета требований ГОСТ 12.1.005-88 "ССБТ.
Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования" и
ГОСТ Р 8.563-96 "ГСИ. Методики выполнения измерений".
Методические указания предназначены для центров
госсанэпиднадзора, санитарных лабораторий биотехнологических
предприятий, микробиологических лабораторий
научно-исследовательских институтов, работающих в области
промышленной гигиены.
2. Биологическая характеристика штамма-продуцента
Streptomyces fradiae БС-1 и его гигиенический норматив
Систематическое положение штамма-продуцента
Порядок Actinomycetales
Класс Actinomycetes
Семейство Streptomycetaceae
Род Streptomyces
Вид fradiae
Штамм БС-1
Культурально-морфологические особенности штамма
Штамм Streptomyces fradiae БС-1 является облигатным аэробом,
растет на различных питательных средах: СР-6, СР-15, Гаузе-1,
Ваксмана путем инкубирования в термостате при температуре 28 -С.
Продолжительность развития составляет 10 - 15 суток.
Четкие культурально-морфологические свойства штамма
проявляются на агаризованной среде СР-15 на 3 день развития. На
этой среде штамм образует 6 морфологических типов колоний, из
которых наиболее характерный тип составляет более 70%. Изучаемый
штамм представлен округлыми колониями до 9 мм в диаметре (в
зависимости от плотности посева). Белый воздушный мицелий
образуется в центре колонии и по периферии в виде одной, реже двух
концентрических окружностей, край колоний не опушен. Профиль
изогнутый, поверхность шероховатая, неопушенные части колоний
гладкие, блестящие, кремовые. Структура мелкозернистая, по краю
неопушенной части однородная. Консистенция плотная, пигмент с
обратной стороны колоний желтовато-коричневый.
Предельно допустимая концентрация Streptomyces fradiae БС-1 в
воздухе рабочей зоны - 2000 кл/куб. м, пометка А, 3 класс
опасности.
3. Пределы измерений
Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток
продуцента тилозина в воздухе рабочей зоны в диапазоне
концентраций от 100 до 50000 клеток в 1 куб. м при доверительной
вероятности 0,95.
4. Метод измерений
Метод измерения концентрации штамма-продуцента Streptomyces
fradiae БС-1 основан на аспирации аппаратом Кротова микробных
клеток (спор, обрывков мицелия) на поверхность плотной питательной
среды СР-15 и подсчете выросших колоний, которые выявляются при
задержке роста тест-культуры (Bacillus subtilis), происходящего
вследствие диффузии в агар антибиотика, выделяемого
штаммом-продуцентом Streptomyces fradiae БС-1.
При данном методе на чашке Петри после забора пробы может быть
учтено до 50 колоний, т.к. большее количество колоний на чашке
могут образовывать сливающиеся зоны лизиса, что приводит к
занижению результатов.
5. Средства измерений, вспомогательные устройства,
реактивы и материалы
При выполнении измерений применяют следующие средства
измерений, вспомогательные устройства и материалы.
5.1. Средства измерений, вспомогательные
устройства, материалы
Прибор для бактериологического анализа воздуха,
модель 818 (щелевой прибор Кротова) ТУ 64-12791-77
Термостаты электрические суховоздушные
или водяные
Автоклав электрический ГОСТ 9586-75
Бокс, оборудованный бактерицидными лампами
Холодильник бытовой
Весы лабораторные аналитические типа ВЛА-200
Микроскоп биологический с иммерсионной
системой типа "Биолам" Л-211
Водяная баня или водяной термостат
Газовая горелка или спиртовка лабораторная
Чашки Петри
Петли бактериологические
Пробирки биологические вместимостью 20 и 35 мл ГОСТ 10515-75
Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл ГОСТ 10515-75
Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл ГОСТ 1770-74
Колбы конические вместимостью 250 и 500 мл ГОСТ 1770-74
Секундомер ГОСТ 9586-75
Барометр ГОСТ 24696-79
Марля медицинская ГОСТ 9412-77
Вата медицинская гигроскопическая ГОСТ 25556-81.
5.2. Реактивы, растворы
Среда СР-15, агаризованная питательная
среда для продуцента тилозина (состав в %:
меласса - 0,5, крахмал - 0,5, соевая мука - 0,5,
кукурузный экстракт - 0,5, (NH ) SO - 0,1,
4 2 4
NaCl - 0,1, MgSO х 7H O - 0,05, СаСО - 0,2,
4 2 3
агар - 1,5; рН среды до стерилизации 7,0 - 7,2;
режим стерилизации 1,1 - 1,2 атм., 40 - 50 мин.)
Агаризованная среда Хоттингера, рН 6,8 - 7,0
Спирт этиловый ректификат ГОСТ 5962-67
Хлороформ
Тетрациклина гидрохлорид
Амфотерицин В для внутривенного введения
Тест-культура Вас. subtilis вариант Л - музейный
2
штамм, споры хранят в виде водной суспензии при
температуре 4 -С.
6. Требования безопасности
При выполнении измерений концентрации клеток продуцента
Биовита и хлортетрациклина в воздухе рабочей зоны соблюдают:
- правила техники безопасности при работе с химическими
реактивами в соответствии с ГОСТ 12.1.005-88;
- правила электробезопасности при работе с электроустановками
в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации
приборов;
- требования, изложенные в руководстве "Положение об
организации работы по технике безопасности в микробиологической
промышленности" (1980);
- положения "Инструкций по устройству, требованиям
безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических
лабораториях предприятий микробиологической промышленности"
(1977).
7. Требования к квалификации оператора
К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются
лица с высшим или средним специальным образованием, прошедшие
соответствующую подготовку и имеющие навыки работы в области
микробиологических исследований.
8. Условия измерений
Процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу
проводят в нормальных условиях в соответствии с ГОСТ 15150-69 при
температуре воздуха (20 +/- 5) -С, атмосферном давлении 630 - 800
мм рт. ст. и влажности воздуха не более 80%.
9. Проведение измерений
9.1. Условия отбора проб воздуха
Для определения концентрации Streptomyces fradiae БС-1 воздух
производственных помещений аспирируют со скоростью 10 л/мин. на
поверхность плотной питательной среды СР-15 в чашку Петри,
помещенную в аппарат Кротова.
Аппарат Кротова перед каждым отбором воздуха тщательно
протирают спиртом. На подвижный диск устанавливают чашку Петри со
средой, одновременно снимая с нее крышку. Крышку прибора
закрывают. После отбора пробы воздуха и остановки диска открывают
крышку прибора, снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной
чашки. В период отбора проб воздуха крышку чашки Петри хранят в
стерильном пакете из бумаги, полиэтилена или других стерильных
емкостях.
Время аспирации воздуха (1 - 10 мин.) зависит от
предполагаемой концентрации клеток штамма-продуцента в воздухе
рабочей зоны.
Отбор проб сопровождается составлением акта отбора с указанием
места, времени и условий отбора.
9.2. Выполнение анализа
Агаризованную среду СР-15 расплавляют и остужают до 50 - 60
-С. Затем добавляют свежеприготовленный в стерильной
дистиллированной воде амфотерицин для инъекций из расчета 20 мкг
на 1 л среды для подавления посторонней воздушной грибковой флоры,
тщательно перемешивают и разливают в стерильные чашки Петри по 10
мл. Чашки с застывшей средой помещают в термостат при 37 -С на
сутки, после чего проросшие чашки бракуют.
После отбора проб воздуха на чашки Петри в аппарате Кротова их
помещают в термостат при температуре 28 - 30 -С на 48 ч.
После инкубации чашки помещают в вытяжной шкаф. На внутреннюю
поверхность наливают 1,5 мл хлороформа, чашку с посевом вверх
донышком вставляют в крышку так, чтобы выросшие колонии бактерий
находились в парах хлороформа не менее 20 - 30 мин. Затем каждую
чашку вынимают из крышки, выливают оставшийся хлороформ, снова
закрывают крышками и переносят в бокс. Чашки оставляют в боксе на
2 ч при комнатной температуре для преддиффузии.
Затем чашки Петри заливают 5 мл агаризованной среды Хоттингера
7
с тест-культурой Вас. subtilis вариант Л из расчета 3 х 10
2
споровых клеток на 1 мл среды (Государственная фармакопея СССР,
изд. XI, 1989, с. 206).
Чашки Петри с застывшей средой Хоттингера донышком вверх
помещают в термостат при 37 -С на сутки. По окончании инкубации,
т.е. через 3 суток после отбора пробы воздуха производят подсчет
зон задержки роста тест-культуры, которые соответствуют числу
проросших клеток штамма-продуцента Streptomyces fradiae БС-1.
Учитывают зоны диаметром не менее 5 мм.
10. Вычисление результатов измерений
Расчет концентрации микробных клеток Streptomyces fradiae БС-1
в 1 куб. м воздуха производят по формуле:
П х 1000
Х = --------,
Т х В
где:
Х - количество микробных клеток в воздухе (1 куб. м);
П - число зон задержки роста тест-культуры, что соответствует
числу колоний, выросших на чашке Петри;
Т - время забора пробы воздуха, мин.;
В - скорость подачи воздуха, л/мин.;
1000 - коэффициент перевода 1 л в 1 куб. м.
11. Оформление результатов измерений
Результаты измерений оформляют протоколом по форме.
Протокол N ____
количественного микробиологического анализа
штамма-продуцента Streptomyces fradiae БС-1
в воздухе рабочей зоны
Дата проведения анализа ______________________________
Место отбора пробы ___________________________________
Название лаборатории _________________________________
Юридический адрес организации ________________________
Результаты микробиологического анализа
-----------------T--------------------------T--------------------¬
¦Шифр или N пробы¦Определяемый микроорганизм¦ Концентрация, ¦
¦ ¦ ¦ кл./куб. м ¦
+----------------+--------------------------+--------------------+
L----------------+--------------------------+---------------------
Ответственный исполнитель
Научный руководитель
Список литературы
1. ГОСТ 12.1.005-88 "ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие
санитарно-гигиенические требования".
2. ГОСТ Р 8.563-96 "ГСИ. Методики выполнения измерений".
3. Положение об организации работы по технике безопасности в
микробиологической промышленности (М., 1980, 27 с.).
4. Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной
гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий
микробиологической промышленности (М., 1977, 7 с.).
5. Государственная фармакопея СССР, 1989, изд. XI, с. 206.
|
