Утверждаю
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации,
Первый заместитель
Министра здравоохранения
Российской Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
20 сентября 2001 года
Дата введения:
с момента утверждения
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
МЕТОД МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ИЗМЕРЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ
КЛЕТОК ПЛЕСНЕВОГО ГРИБА PENICILLIUM FUNICULOSUM
F-149 - ПРОДУЦЕНТА ДЕКСТРАНАЗЫ В ВОЗДУХЕ РАБОЧЕЙ ЗОНЫ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
МУК 4.2.1069-01
1. Разработаны д.м.н. Ивановым Н.Г., к.б.н. Шеиной Н.И.
(Российский государственный медицинский университет).
2. Утверждены и введены в действие Главным государственным
санитарным врачом Российской Федерации - Первым заместителем
Министра здравоохранения Российской Федерации 20 сентября 2001 г.
3. Введены впервые.
1. Общие положения и область применения
Настоящие методические указания устанавливают методику
проведения микробиологического количественного анализа
концентрации клеток штамма Penicillium funiculosum F-149 -
продуцента декстраназы в воздухе рабочей зоны в диапазоне
концентраций от 100 до 5000 клеток в 1 куб. м воздуха.
Методические указания разработаны в соответствии с
требованиями ГОСТ 12.1.005-88 "ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие
санитарно-гигиенические требования" и ГОСТ Р 8.563-96 "Методики
выполнения измерений".
Методические указания предназначены для применения в
лабораториях предприятий, организаций и учреждений,
аккредитованных в установленном порядке на право проведения
микробиологических исследований.
2. Биологическая характеристика плесневого гриба
Penicillium funiculosum F-149 и его гигиенический норматив
Систематическое положение микроорганизма
Класс Fungi imperfecti
Порядок Hyphomycetales
Семейство Mucedinaceae
Род Penicillium
Секция Biverticillata
Вид funiculosum
Штамм F-149
Округлые колонии имеют 4 - 5 мм в диаметре, в зависимости от
плотности посева могут достигать 11 мм в диаметре. Поверхность
колоний слабошероховатая, пушистая, консистенция мягкая. Воздушный
мицелий имеет белоснежно-белую окраску. На 3 - 4 день развития
желтовато-кремовый субстрат меняет свою окраску, становясь
ярко-оранжевым. Продолжительность развития гриба составляет 26 -
30 дней. Репродуктивными органами гриба являются конидиеносцы с
конидиями (споры), может также размножаться вегетативно
(фрагментами мицелия).
Штамм Penicillium funiculosum F-149 получен из Всероссийской
коллекции промышленных микроорганизмов ГНИИгенетики. Штамм
является продуцентом декстраназы. Активность по методу Нельсона
составляет 10 - 12 ед./мл культуральной жидкости. Изучаемый штамм
выделен из почвы, аэроб, растет на жидких и агаризованных средах.
Оптимальная температура роста 28 - 30 -С, оптимальный рН 6 - 8.
Наиболее интенсивный рост наблюдается на агаризованном пивном
сусле 7 -Б, для выращивания могут также использоваться
картофельно-сахарозный агар, агаризованная среда Чапека, среда
Чапека - Докса.
Предельно допустимая концентрация (ПДК) в воздухе рабочей зоны
- 2000 кл./куб. м, пометка А.
3. Пределы измерений
Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток
плесневого гриба в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций
от 100 до 3000 клеток в 1 куб. м воздуха при доверительной
вероятности 0,95.
4. Метод измерений
Метод основан на аспирации из воздуха клеток плесневого гриба
на поверхность плотной питательной среды и подсчете выросших
колоний по типичным морфологическим признакам и ярко-оранжевому
окрашиванию субстрата на 3 - 4 сутки. Вопрос о корреляции между
пигментной и ферментативной активностью плесневого гриба требует
дополнительных исследований.
5. Средства измерений, вспомогательные устройства,
реактивы и материалы
При выполнении измерений применяют следующие средства
измерений, вспомогательные устройства и материалы.
5.1. Средства измерений, вспомогательные
устройства, материалы
Прибор для бактериологического анализа
воздуха, модель 818
(щелевой прибор Кротова) ТУ 64-12791-77
Термостаты электрические суховоздушные
или водяные
Автоклав электрический ГОСТ 9586-75
Бокс, оборудованный бактерицидными лампами
Холодильник бытовой
Весы лабораторные аналитические типа ВЛА-200
Микроскоп биологический с иммерсионной
системой типа "Биолам" Л-211
Лупа с увеличением х10 ГОСТ 25706-83
Чашки Петри бактериологические плоскодонные
стеклянные диаметром 100 мм
Пробирки биологические вместимостью 20 и 35 мл ГОСТ 10515-75
Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл ГОСТ 10515-75
Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл ГОСТ 1770-74
Колбы конические вместимостью 250 и 500 мл ГОСТ 1770-74
Секундомер ГОСТ 9586-75
Барометр ГОСТ 24696-79
Марля медицинская ГОСТ 9412-77
Вата медицинская гигроскопическая ГОСТ 25556-81.
5.2. Реактивы, растворы
Антибиотики группы аминогликозидов: канамицин,
неомицин и др.
Спирт этиловый ректификат ГОСТ 5962-67
Агаризованное пивное сусло 7 -Б для штамма-
продуцента (агар - 1,8%, рН 6,8, режим
стерилизации 1,1 - 1,2 атм. в течение 30 мин.).
6. Требования безопасности
При выполнении измерений концентрации клеток штамма-продуцента
в воздухе рабочей зоны соблюдают:
- правила техники безопасности при работе с химическими
реактивами по ГОСТ 12.1.005-88;
- правила электробезопасности при работе с электроустановками
по ГОСТ 12.1.019-79 и инструкцию по эксплуатации прибора;
- требования, изложенные в руководстве "Положение об
организации работы по технике безопасности в микробиологической
промышленности" (1980);
- положения "Инструкций по устройству, требованиям
безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических
лабораториях предприятий микробиологической промышленности"
(1977).
Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу
при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом
осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.
7. Требования к квалификации операторов
К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются
лица с высшим или средним специальным образованием, прошедшие
соответствующую подготовку и имеющие навыки работы в области
микробиологических исследований.
8. Условия измерений
Процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу
проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20 +/- 5)
-С, атмосферном давлении 630 - 800 мм рт. ст. и влажности воздуха
не более 80%.
9. Проведение измерений
9.1. Условия отбора проб воздуха
Для определения концентрации клеток плесневого гриба воздух
аспирируют при помощи аппарата Кротова со скоростью 10 л/мин. на
поверхность плотной питательной среды - пивное агаризованное сусло
7 -Б. Время аспирации воздуха (1 - 10 мин.) зависит от
предполагаемой концентрации клеток штамма-продуцента.
Аппарат Кротова перед каждым отбором пробы воздуха тщательно
протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность
подвижного диска и внутреннюю стенку прибора, наружную и
внутреннюю стенку крышки. На подвижный диск устанавливают
подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее
крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой
недопустимо. После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор
открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от
данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку
контроля, время аспирации и дату отбора пробы.
9.2. Выполнение анализа
Метод предполагает учет количества типичных по морфологическим
признакам колоний, выросших на 3 - 4 сутки после посева воздуха.
Прямой метод позволяет учитывать на чашке до 200 колоний
продуцента.
Агаризованное пивное сусло 7 -Б расплавляют, остужают до 50 -
60 -С, добавляют свежеприготовленный в стерильной дистиллированной
воде раствор антибиотика (канамицин, неомицин и др.) из расчета 20
- 30 мг на 1 л среды (для подавления посторонней бактериальной
микрофлоры), тщательно перемешивают и разливают по 10 мл в
стеклянные чашки Петри на горизонтальной поверхности.
Чашки с застывшей средой помещают в термостат на сутки при
температуре 37 -С, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные
чашки используют для контроля воздуха.
После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат при
температуре 28 - 30 -С. Через 72 ч производят подсчет выросших
типичных колоний продуцента. При необходимости культуру подвергают
микроскопированию.
10. Вычисление результатов измерений
Расчет концентрации клеток продуцента в пересчете на 1 куб. м
воздуха производят по формуле:
N х 1000
Х = --------, кл./куб. м,
V
где:
Х - концентрация клеток продуцента в воздухе;
N - количество колоний продуцента, выросших на чашке;
1000 - коэффициент пересчета на 1 куб. м воздуха;
V - объем воздуха, л (произведение скорости на время
аспирации).
В случае невозможности использования аппарата Кротова
рекомендуем применять метод седиментации клеток продуцента из
воздуха непосредственно на чашки Петри с плотной питательной
средой. Время отбора проб воздуха может составлять до 30 мин. При
использовании этого метода пользуются следующим расчетом
концентрации клеток продуцента:
эмпирически установлено, что за 5 мин. на площадь 100 кв. см
оседает количество бактерий, содержащееся в 10 л воздуха,
следовательно, за 1 мин. - количество бактерий из 2 л воздуха.
Площадь чашки Петри диаметром 100 мм равна 78,54 кв. см. Составляя
пропорцию, определяем, что за 1 мин. на стеклянную чашку Петри
оседают клетки, содержащиеся в 1,57 л воздуха. Количество клеток в
1 куб. м воздуха определяем по вышеприведенной формуле, где V =
1,57 л/мин. х t (время аспирации, мин.).
Предлагаемый метод является ориентировочным и может быть
использован как вспомогательный метод.
11. Оформление результатов измерений
Результаты измерений оформляют протоколом по форме.
Протокол N _____
количественного микробиологического анализа
штамма-продуцента Penicillium funiculosum F-149
в воздухе рабочей зоны
Дата проведения анализа ______________________________
Место отбора пробы ___________________________________
Название лаборатории _________________________________
Юридический адрес организации ________________________
Результаты микробиологического анализа
-----------------T--------------------------T--------------------¬
¦Шифр или N пробы¦Определяемый микроорганизм¦ Концентрация, ¦
¦ ¦ ¦ кл./куб. м ¦
+----------------+--------------------------+--------------------+
L----------------+--------------------------+---------------------
Ответственный исполнитель
Научный руководитель
Список литературы
1. ГОСТ 12.1.005-88 "ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие
санитарно-гигиенические требования".
2. ГОСТ Р 8.563-96 "ГСИ. Методики выполнения измерений".
3. Положение об организации работы по технике безопасности в
микробиологической промышленности (М., 1980, 27 с.).
4. Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной
гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий
микробиологической промышленности (М., 1977, 7 с.).
|
