Утверждаю
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации,
Первый заместитель
Министра здравоохранения
Российской Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
11 декабря 2003 года
Дата введения:
1 марта 2004 года
4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АВЕРСЕКТИНА С (ПО АВЕРМЕКТИНУ В1а)
В АТМОСФЕРНОМ ВОЗДУХЕ НАСЕЛЕННЫХ МЕСТ МЕТОДОМ
ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
МУК 4.1.1795а-03
1. Подготовлены Российским государственным медицинским
университетом (Е.Б. Гугля).
2. Утверждены Главным государственным санитарным врачом
Российской Федерации - Первым заместителем Министра
здравоохранения Российской Федерации Г.Г. Онищенко 11 декабря 2003
г. и введены в действие с 1 марта 2004 г.
3. Введены впервые.
Настоящие методические указания устанавливают методику
количественного химического анализа воздуха для определения в нем
авермектина В (10Е,14Т,16Е,2Z)-(1R,4S,S',6S,6'R,8R,12S,20R,21R,
1а
24S)-6'-[(S)]-sec-бутил]-21,24-гидрокси-S',11,13,22-тетраметил-2-
оксо-3,7,19-триоксатетрацикло=[16,61]-4,8О,22,24-пентакоза-0,14,
16,22-тетраен-6-спиро-2'(5',6'-дигидро-2Н-пиран)-12-ил-2,6-
дидеокси-4-2-(2,60-дидеокси-3-0-метил-альфа-1-арабино=
гексапиранозил)-3=0-метил-альфа-арабиногекса-пиранозида) в
диапазоне концентраций 0,001 - 0,02 мг/куб. м методом
высокоэффективной жидкостной хроматографии.
Структурная формула (не приводится).
Авермектин В - один из восьми компонентов аверсектина С,
1а
противопаразитарного препарата, представляющего собой смесь
близких в химическом отношении авермектинов - природных 16-членных
макроциклических лактонов, продуктов жизнедеятельности культуры
Streptomycis avermitilis (табл. 1). Компоненты А и В имеют
1 1
двойную связь в положении 22 - 23 (см. рисунок - не приводится), у
компонентов А и В эта связь восстановлена. Содержание компонента
2 2
В в смеси составляет не менее 40%.
1а
Таблица 1
СТРОЕНИЕ АВЕРМЕКТИНОВ
--------------T--------------T--------------T--------------------¬
¦ Тип ¦ Эмпирическая ¦ Молекулярная ¦ Заместители ¦
¦ авермектина ¦ формула ¦ масса +----------T---------+
¦ ¦ ¦ ¦ R ¦ R ¦
¦ ¦ ¦ ¦ 5 ¦ 26 ¦
+-------------+--------------+--------------+----------+---------+
¦А ¦С Н О ¦886 ¦ОСН ¦С Н ¦
¦ 1а ¦ 49 74 14 ¦ ¦ 3 ¦ 2 5 ¦
+-------------+--------------+--------------+----------+---------+
¦А ¦С Н О ¦904 ¦ОСН ¦С Н ¦
¦ 2а ¦ 48 76 15 ¦ ¦ 3 ¦ 2 5 ¦
+-------------+--------------+--------------+----------+---------+
¦В ¦С Н О ¦872 ¦ОН ¦С Н ¦
¦ 1а ¦ 48 72 14 ¦ ¦ ¦ 2 5 ¦
+-------------+--------------+--------------+----------+---------+
¦В ¦С Н О ¦890 ¦ОН ¦С Н ¦
¦ 2а ¦ 48 74 15 ¦ ¦ ¦ 2 5 ¦
+-------------+--------------+--------------+----------+---------+
¦А ¦С Н О ¦872 ¦ОСН ¦СН ¦
¦ 1b ¦ 49 72 14 ¦ ¦ 3 ¦ 3 ¦
+-------------+--------------+--------------+----------+---------+
¦А ¦С Н О ¦890 ¦ОСН ¦СН ¦
¦ 2b ¦ 49 74 15 ¦ ¦ 3 ¦ 3 ¦
+-------------+--------------+--------------+----------+---------+
¦В ¦С Н О ¦858 ¦ОН ¦СН ¦
¦ 1b ¦ 47 70 14 ¦ ¦ ¦ 3 ¦
+-------------+--------------+--------------+----------+---------+
¦В ¦С Н О ¦876 ¦ОН ¦СН ¦
¦ 2b ¦ 47 70 15 ¦ ¦ ¦ 3 ¦
L-------------+--------------+--------------+----------+----------
Регистрационный номер по САS 73989-17-0.
Аверсектин С - порошок белого или желтовато-белого цвета,
легко растворим в хлорированных углеводородах, ацетоне, бензоле,
растворим в низших спиртах, практически не растворим в воде,
петролейном эфире. Температуры плавления авермектинов (с
разложением) составляют около 150 -С.
Агрегатное состояние в воздухе - аэрозоль.
Аверсектин С обладает общетоксическим действием. Класс
опасности - первый. Предельно допустимая среднесуточная
концентрация аверсектина С (по авермектину В ) в атмосферном
1а
воздухе - 0,002 мг/куб. м.
1. Погрешность измерений
Методика обеспечивает выполнение измерений с погрешностью, не
превышающей +/- 25%, при доверительной вероятности 0,95.
2. Метод измерений
Измерение массовой концентрации авермектина В основано на
1а
улавливании препарата аверсектина С из воздуха и концентрировании
на фильтре, экстракции с фильтра этиловым спиртом, упаривании
досуха, получении флуоресцирующих производных авермектинов путем
их дериватизации 1-метилимидазолом и трифторуксусным ангидридом в
ацетонитриле, с последующим количественным определением
производного авермектина В методом обращенно-фазовой ВЭЖХ путем
1а
элюирования водно-органическим элюентом с аналитической колонки
Диасорб С-16Т и детектирования флуоресцентным детектором при
длинах волн возбуждения и испускания 365 и 470 нм соответственно.
Нижний предел измерения авермектина В в объеме элюируемой
1а
пробы - 2,0 нг. Определению не мешают другие авермектины.
3. Средства измерений, вспомогательные устройства,
материалы, реактивы
При выполнении измерений применяют следующие средства
измерений, вспомогательные устройства, материалы и реактивы.
3.1. Средства измерений
Хроматограф жидкостный с флуоресцентным
детектором (Du Pont 8800, США)
Компьютерная программа Мультихром 1.5х
Весы аналитические ГОСТ 24104-88Е
Меры массы ГОСТ 7328-82Е
Автоматические пипетки ГН ТУ 64-1-3329-81
Пипетки вместимостью 1, 5 и 10 куб. см ГОСТ 20292-74
Колбы мерные вместимостью 25 и 100 куб. см ГОСТ 1770-74Е.
3.2. Вспомогательные устройства
Колонка хроматографическая стальная длиной
250 мм и внутренним диаметром 4 мм,
заполненная сорбентом Диасорб-130-С16Т с
размером частиц 6 мкм (БиоХимМак, Россия)
Пробоотборное устройство АПВ-4-220В-40
Фильтродержатель ТУ 95.72.05-77
Воронка фильтровальная ВФ-20/16 ГОСТ 25336-82
Набор для фильтрации жидкостей
(НПФ Биохром, Россия)
Пробирки с пришлифованными пробками ГОСТ 10515-72
Бюксы 50/30 ГОСТ 25336-82Е
Центрифуга низкоскоростная
Центрифужные пробирки стеклянные
вместимостью 5 куб. см с полиэтиленовыми
пробками
Ультразвуковой диспергатор УЗДН-1М
Морозильная камера или холодильник
Вакуумный испаритель ротационный ИР-1М ТУ 25-11-917-76.
3.3. Материалы
Фильтры АФА-ВП-20 ТУ 95-743-80.
3.4. Реактивы
Авермектин В , содержание авермектина РСО 9340-201-00-494189-99
1
В 88,88%
1а
Аверсектин С, содержание авермектина ТУ 9383-009-17266133-97
В не менее 40%
1а
Спирт метиловый, хч ГОСТ 6995-77
Спирт этиловый, хч ТУ 6-0951710-72
1-Метилимидазол импортный (Меrk,
Германия)
Трифторуксусный ангидрид импортный
(Меrk, Германия)
Ацетонитрил "для жидкостной ТУ 6-09-14-2167-84
хроматографии"
Вода дистиллированная ГОСТ 6709-72.
Допускается применение иных средств измерения, вспомогательных
устройств, реактивов и материалов, обеспечивающих показатели
точности, установленные для данных методических указаний.
4. Требования безопасности
При работе с реактивами соблюдают требования безопасности,
установленные для работы с токсичными, едкими и
легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1005-88.
При выполнении измерений с использованием хроматографа
соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ
12.1.019-79 и инструкцией по эксплуатации прибора.
5. Требования к квалификации оператора
К выполнению измерений и обработке результатов допускают лиц с
высшим и средним специальным образованием, имеющих навыки работы
на жидкостном хроматографе.
6. Условия измерений
Приготовление растворов и подготовку проб к анализу проводят в
нормальных условиях при температуре воздуха (20 +/- 10) -С,
атмосферном давлении 84 - 106 кПа и влажности воздуха не более
80%.
7. Подготовка к выполнению измерений
Перед выполнением измерений проводят приготовление растворов,
подготовку прибора, установление градуировочной характеристики,
отбор проб.
7.1. Приготовление растворов
Стандартный раствор N 1 авермектина В для градуировки.
1
Раствор авермектина В с концентрацией 100 мкг/куб. см готовят
1
путем растворения точной навески 5,0 мг рабочего стандартного
образца в этиловом спирте в мерной колбе объемом 50 куб. см.
Раствор хранят не более 2 месяцев в холодильнике.
Стандартный раствор N 2 авермектина В с концентрацией
1
авермектина В 0,889 мкг/куб. см (авермектина В 1,0 мкг/куб. см)
1а 1
готовят путем разведения 1 куб. см стандартного раствора N 1
этиловым спиртом в мерной колбе объемом 100 куб. см. Раствор
хранят не более 2 недель в холодильнике.
Реакционную смесь готовят из трифторуксусного ангидрида и
ацетонитрила в соотношении 1:2. Смесь готовят в день работы,
помещают в холодильник при 0 -С и не хранят.
Раствор элюента готовят смешиванием в мерном цилиндре 98 куб.
см метилового спирта и 2 куб. см воды. Непосредственно перед
измерением раствор фильтруют с помощью устройства для фильтрации и
фильтров "Дюрапор" и дегазируют под вакуумом.
Градуировочные растворы готовят разбавлением стандартного
раствора N 2 этиловым спиртом в мерных колбах объемом 25 куб. см
согласно табл. 2. Вносят пипеткой рабочий раствор в мерные колбы
вместимостью 25 куб. см в соответствии с табл. 2, доводят уровень
этиловым спиртом до метки и перемешивают. Градуировочные растворы
устойчивы в течение недели при хранении в холодильнике.
Таблица 2
ГРАДУИРОВОЧНЫЕ РАСТВОРЫ ДЛЯ УСТАНОВЛЕНИЯ ГРАДУИРОВОЧНОЙ
ХАРАКТЕРИСТИКИ ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ КОНЦЕНТРАЦИИ
АВЕРМЕКТИНА В В ВОЗДУХЕ
1а
-----------------------T-T------T------T------T-----T------T-----¬
¦Номер раствора ¦1¦2 ¦3 ¦4 ¦5 ¦6 ¦7 ¦
+----------------------+-+------+------+------+-----+------+-----+
¦Объем стандартного ¦0¦1,0 ¦1,5 ¦2,5 ¦5,0 ¦10,0 ¦20,0 ¦
¦раствора N 2, куб. см ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+----------------------+-+------+------+------+-----+------+-----+
¦Концентрация авермек- ¦0¦0,0352¦0,0528¦0,0889¦0,176¦0,352 ¦0,711¦
¦тина В , мкг/куб. см ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ 1а ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+----------------------+-+------+------+------+-----+------+-----+
¦Содержание авермектина¦0¦2,01 ¦3,02 ¦5,08 ¦10,06¦20,11 ¦40,2 ¦
¦В в хроматографиру- ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ 1а ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦емом объеме пробы, нг ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
L----------------------+-+------+------+------+-----+------+------
7.2. Подготовка прибора
Общую подготовку прибора осуществляют согласно инструкции по
эксплуатации.
7.3. Установление градуировочной характеристики
Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади
пика авермектина В (в условных единицах) от количества массы
1а
(мкг) авермектина В в хроматографируемом объеме пробы,
1а
устанавливают по методу абсолютной градуировки с использованием
градуировочных растворов авермектина В .
1
Для построения градуировочной характеристики отбирают по 2,0
куб. см каждого градуировочного раствора, помещают в центрифужные
пробирки и упаривают досуха на вакуумном испарителе. В каждую
пробирку с сухим остатком вносят по 0,5 куб. см ацетонитрила,
пробирку энергично встряхивают и обрабатывают ультразвуком в
течение 30 с. Затем пробирку повторно встряхивают и повторно
обрабатывают ультразвуком. В каждую пробирку вносят по 0,05 куб.
см 1-метилимидазола. Пробирку закрывают, тщательно перемешивают
содержимое в течение 5 - 10 с, обрабатывают ультразвуком,
центрифугируют и помещают в холодильник при 0 -С на 10 мин. После
охлаждения в пробирку с образцом вносят 0,15 куб. см охлажденной
реакционной смеси. Пробирку закрывают и выдерживают в холодильнике
в течение 1 часа. Общий объем раствора пробы после проведения
реакции - 0,7 куб. см.
Растворы помещают в пробоотборное устройство хроматографа.
Условия хроматографирования градуировочных смесей и анализируемых
проб:
состав элюента: метиловый спирт - вода,
98:2
скорость потока элюента 2,0 куб. см/мин.
объем вводимой пробы 20 куб. мм
длины волн флуоресцентного детектора 365/470 нм
время удерживания авермектина:
В , 9,7 мин.
1в
В 12,2 мин.
1а
На полученных хроматограммах измеряют площадь пика авермектина
В с помощью компьютерной программы (в условных единицах).
1а
Анализируют 6 растворов разных концентраций, проводя не менее 5
параллельных определений для каждого раствора, и строят
градуировочную характеристику.
Проверку градуировочной характеристики проводят при изменении
условий анализа, но не реже 1 раза в неделю.
7.4. Отбор проб
Отбор проб воздуха проводят согласно ГОСТ 17.2.3.01-86. Воздух
с объемным расходом 20 куб. дм/мин. аспирируют через фильтр АФА
ВП-20. Для измерения 1/2 ПДК достаточно отобрать 350 куб. дм.
Пробы можно хранить не более десяти суток в защищенном от света
месте.
Отбор проб сопровождается составлением акта отбора с
указанием, при какой температуре и давлении он проводился.
8. Выполнение измерений
Фильтр с отобранной пробой помещают в пробирку и приливают
пипеткой 10 куб. см этилового спирта. Периодически встряхивая,
выдерживают в течение 10 мин. Экстракт фильтруют через воронку с
пористой пластинкой N 1 или N 2 и сливают в пробирку с притертой
пробкой. Степень экстракции с фильтра 93%. Отбирают 2 куб. см
экстракта, помещают в центрифужную пробирку и упаривают досуха.
Далее проводят химическую трансформацию и хроматографический
анализ, аналогично тому, как описано в п. 7.3 для градуировочных
растворов. Количественное определение содержания анализируемого
компонента В в растворе проводят по предварительно построенной
1а
градуировочной характеристике.
9. Вычисление результатов измерений
Концентрацию авермектина В "С" (мг/куб. м) в воздухе
1а
вычисляют по формуле:
а х в х г
С = ---------,
б х V х д
где:
а - содержание авермектина В в хроматографируемом объеме
1а
пробы, найденное по градуировочной характеристике, мкг;
б - объем пробы, взятый для хроматографирования, куб. см;
в - общий объем раствора пробы после проведения химической
реакции, куб. см;
г - объем жидкой пробы после экстракции с фильтра, куб. см;
д - объем жидкой пробы, взятой для упаривания, куб. см;
V - объем воздуха, отобранного для анализа и приведенного к
стандартным условиям, куб. дм (см. прилож. 2 - не приводится).
Концентрацию аверсектина С "С " (мг/куб. м) в воздухе
1
вычисляют по формуле:
С
С = -,
1 К
где:
С - концентрация авермектина В , мг/куб. м;
1а
К - массовая доля авермектина В в аверсектине С согласно ТУ
1а
9383-009-17266133-97.
10. Оформление результатов измерений
Результаты измерений оформляют протоколом по форме:
Протокол N ____
количественного химического анализа аверсектина в воздухе
1. Дата проведения анализа _______________________________________
2. Место отбора пробы ____________________________________________
3. Название лаборатории __________________________________________
4. Юридический адрес лаборатории _________________________________
Результаты химического анализа
--------------T------------------T---------------T---------------¬
¦ Шифр или ¦ Определяемый ¦ Концентрация, ¦ Погрешность ¦
¦ N пробы ¦ компонент ¦ мг/куб. м ¦ измерения, % ¦
+-------------+------------------+---------------+---------------+
L-------------+------------------+---------------+----------------
Ответственный исполнитель:
Научный руководитель:
11. Контроль погрешности измерений
11.1. Метрологическая аттестация методики
Метрологическую аттестацию проводят в соответствии с ГОСТ Р
8.563-96, МИ 2336-95 и МИ 2335-95 (см. прилож. 2). Значения
характеристики погрешности, норматива оперативного контроля
погрешности и норматива оперативного контроля воспроизводимости
приведены в табл. 3 в виде зависимости от значения массовой
концентрации анализируемого компонента в пробе С. Концентрацию
определяют как среднеарифметическое результатов параллельных
определений.
Таблица 3
РЕЗУЛЬТАТЫ МЕТРОЛОГИЧЕСКОЙ АТТЕСТАЦИИ МЕТОДИКИ
КОЛИЧЕСТВЕННОГО ХИМИЧЕСКОГО АНАЛИЗА
АВЕРМЕКТИНА В
1а
-------------T---------------------------------------------------¬
¦ Диапазон ¦ Наименование метрологической характеристики ¦
¦определяемых+---------------T----------------T------------------+
¦концентраций¦характеристика ¦норматив опера- ¦норматив оператив-¦
¦авермектина ¦ погрешности ¦тивного контроля¦ного контроля ¦
¦ В , ¦ ДЕЛЬТА, ¦точности К, ¦воспроизводимости ¦
¦ 1а ¦ мг/куб. м; ¦мг/куб. м; ¦D, мг/куб. м; ¦
¦ мг/куб. м ¦ Р = 0,95 ¦Р = 0,90, m = 2 ¦Р = 0,95, m = 2 ¦
+------------+---------------+----------------+------------------+
¦от 0,001 ¦0,20С + 0,00005¦0,21С + 0,00006 ¦0,12С + 0,00014 ¦
¦до 0,02 ¦ ¦ ¦ ¦
L------------+---------------+----------------+-------------------
11.2. Оперативный контроль воспроизводимости
Оперативный контроль воспроизводимости выполняют в одной серии
с анализом рабочих проб. Отбирают реальные пробы воздуха из одного
традиционного места отбора двумя пробоотборниками одновременно.
Анализируют в соответствии с прописью методики разными
аналитиками, максимально варьируя условия проведения анализа:
партии реактивов, наборы мерной посуды и т.д., и получают два
результата С и С анализов. Результаты анализа не должны
1 2
отличаться друг от друга на величину большую, чем норматив
оперативного контроля воспроизводимости D:
¦С - С ¦ <= D.
1 2
При превышении расхождения между двумя результатами норматива
оперативного контроля воспроизводимости эксперимент повторяют. При
повторном превышении указанного норматива выясняют причины,
приводящие к неудовлетворительным результатам, и устраняют их.
Внутренний оперативный контроль воспроизводимости проводят не
реже чем 1 раз в месяц.
11.3. Оперативный контроль точности
Оперативный контроль точности выполняют в одной серии с
анализом рабочих проб. Отбирают реальные пробы воздуха из одного
традиционного места отбора двумя пробоотборниками одновременно.
Затем к одной пробе, отобранной на фильтр, делают добавку
анализируемого компонента дельта С из раствора, нанося его на
фильтр. Результаты анализа С без добавки и С с добавкой получают
1 2
по возможности в одинаковых условиях: одним аналитиком, с одной
партией реактивов, с одним набором посуды и т.д. Величина добавки
дельта С должна соответствовать 50 - 150% от содержания компонента
в пробе, а величина С не должна выходить за верхнюю границу
2
диапазона измерения.
Погрешность процедуры отбора проб контролируют путем поверки
используемых пробоотборников. Расчет норматива оперативного
контроля погрешности К проводят по характеристике погрешности
методики за вычетом характеристики погрешности пробоотборника.
Решение об удовлетворительной погрешности принимают при выполнении
условия:
¦С - С - дельта С¦ <= К.
2 1
Внутренний оперативный контроль точности проводят не реже чем
1 раз в месяц.
Методические указания разработаны: ООО НБЦ "Фармбиомед" (В.Т.
Тер-Симонян, Е.Б. Кругляк), Российский государственный медицинский
университет (Е.Б. Гугля).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Diserens Н., Henzelin М. //Journal of Chromatography А.,
1999. V. 833. N 1. Р. 13 - 18.
2. Руководство по контролю загрязнения атмосферы. РД
52.04.186-96. М., 1991, 693 с.
3. Agency for Toxic Substances and Disease Registry. Atlanta,
1989 and 1990, 184 с.
4. Дмитриев М.Т., Казнина Н.И., Пинигина И.А.
Санитарно-химический анализ загрязняющих веществ в окружающей
среде. Справ. изд. М.: Химия, 1989, 368 с.
5. ГОСТ Р 8.563-96. ГСИ. Методики выполнения измерений.
6. ГОСТ 17.2.4.02-81. Охрана природы. Атмосфера. Общие
требования к методам определения загрязняющих веществ. М.: Изд-во
стандартов, 1981, 3 с.
7. МИ 2336-95. Рекомендация ГСИ. Характеристики погрешности
результатов количественного химического анализа. Алгоритмы
оценивания. Екатеринбург, 1995, 44 с.
8. МИ 2335-95. Рекомендация ГСИ. Внутренний контроль качества
результатов количественного химического анализа. Екатеринбург,
1995, 56 с.
|