Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
21 апреля 2005 года
Дата введения -
1 июля 2005 года
4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ СУБТИЛИЗИНА (ПРОТЕАЗЫ)
В АТМОСФЕРНОМ ВОЗДУХЕ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
МУК 4.1.1959-05
1. Разработаны ГУ НИИ экологии человека и гигиены окружающей
среды им. А.Н. Сысина РАМН (к.х.н. А.А. Беззубовым) и НИЦ "ЭКОС"
(В.А. Смирновым).
2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в
сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным
государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.
Онищенко 21 апреля 2005 г.
3. Введены в действие с 1 июля 2005 г.
4. Введены впервые.
1. Область применения
Настоящие Методические указания устанавливают количественный
спектрофотометрический анализ атмосферного воздуха для определения
в нем субтилизина (протеазы) в диапазоне концентраций 0,005 - 0,05
мг/куб. м.
Методические указания предназначены для использования
лабораториями центров гигиены и эпидемиологии при осуществлении
аналитического контроля химического загрязнения атмосферного
воздуха в районе расположения производства субтилизина (протеазы),
производственными лабораториями предприятий, научно-
исследовательскими институтами, работающими в области гигиены
окружающей среды.
Методические указания разработаны в соответствии с требованиями
ГОСТ Р 8.563-96 "Методика выполнения измерений", ГОСТ 17.2.4.02-81
"Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методам определения
загрязняющих веществ".
Методические указания одобрены и рекомендованы к практическому
применению на бюро секции по физико-химическим методам
исследования объектов окружающей среды Проблемной комиссии
"Научные основы экологии человека и гигиены окружающей среды" и
бюро Комиссии по государственному санитарно-эпидемиологическом
нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав
потребителей и благополучия человека.
2. Физико-химические и токсикологические свойства
Субтилизин (протеаза) является ферментом класса гидролаз и
катализирует гидролиз белков и пептидов, а также сложных эфиров и
амидов N-защищенных аминокислот. Продуцируется Bacillus subtilis и
родственными бактериями. Молекулярная масса более 27000.
Выпускается в виде гранул кремового цвета со слабым запахом.
Растворим в воде и растворах щелочей. Применяется в химической
промышленности, в частности, как добавка к синтетическим моющим
средствам.
Субтилизин (протеаза) обладает раздражающим действием на кожу и
слизистые оболочки глаз, является аллергеном. В атмосферном
воздухе находится в виде аэрозоля. ОБУВ протеазы щелочной - 0,01
мг/куб. м.
3. Погрешность измерений
Методика обеспечивает выполнение измерений с погрешностью, не
превышающей +/- 21%. При доверительной вероятности 0,95.
4. Метод измерений
Измерение концентраций субтилизина (протеазы) основано на
улавливании его из воздуха и концентрировании на фильтре с
последующей десорбцией 2 Н раствором гидрооксида натрия, реакции
образования окрашенного комплекса с солью меди (метод Лоури) и
последующем спектрофотометрировании при длине волны 650 нм.
Нижний предел измерения содержания субтилизина (протеазы) в
анализируемом объеме пробы - 10 мкг.
Измерению мешают фенол, тимол, сульфосалицил, а также белки.
5. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы
При выполнении измерений применяют следующие средства
измерений, вспомогательные устройства, материалы и реактивы.
5.1. Средства измерений
Спектрофотометр СФ-46 или
аналогичный прибор
Весы аналитические ВЛА-200 ГОСТ 24104-01
Меры массы ГОСТ 7328-01
Колбы мерные, вместимостью 25, 100 и 1000 куб. см ГОСТ 1770-74Е
Пипетки, вместимостью 1, 2, 5 и 10 куб. см ГОСТ 29196-91
Бюксы, вместимостью 25 куб. см ГОСТ 25336-83Е
Пробирки колориметрические с притертыми
пробками, вместимостью 20 куб. см ГОСТ 25336-82Е
Барометр-анероид М-67 ТУ 2504-1797-75
Термометр лабораторный шкальный ТЛ-2 ГОСТ 215-73Е
Секундомер ГОСТ 5072-79
Электроаспиратор марки 822 ГОСТ 2.6.01-86
5.2. Вспомогательные устройства
Фильтродержатель с металлической сеткой ТУ 6-09-1706-77
Баня водяная ТУ 64-1-2850-76
Дистиллятор ТУ 61-1-721-79
5.3. Материалы
Фильтр АФА-ХА-20 ТУ 95-743-80
5.4. Реактивы
Протеаза с содержанием основного вещества
не менее 95% СП 23701-81
Гидрооксид натрия, хч ГОСТ 4328-77
Кислота соляная, хч ГОСТ 4461-77
Натрий углекислый, хч ГОСТ 84-76
Калий-натрий тартрат, хч ГОСТ 5845-70
Медь серно-кислая, хч ГОСТ 4165-78
Натрий вольфрамово-кислый, хч ГОСТ 18289-76
Натрий молибденово-кислый, хч ГОСТ 10931-74
Литий серно-кислый, хч ГОСТ 10563-76
Кислота ортофосфорная, хч ГОСТ 10678-76
Бром
Фенолфталеин
6. Требования безопасности
6.1. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности,
установленные для работы с токсичными, едкими и
легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.005-88.
6.2. При выполнении измерений концентраций субтилизина
(протеазы) с использованием спектрофотометра СФ-46 и
электроаспиратора следует соблюдать правила электробезопасности в
соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкциями по эксплуатации
приборов.
7. Требования к квалификации оператора
К выполнению измерений и обработке их результатов на
спектрофотометре и электроаспираторе допускаются лица, знающие
устройство и правила эксплуатации приборов.
8. Условия измерений
При выполнении измерений соблюдают следующие условия:
8.1. Процессы приготовления растворов и подготовки проб к
анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20
+/- 5) -С, атмосферном давлении 630 - 800 мм рт. ст. и влажности
воздуха не более 80%.
8.2. Выполнение измерений на спектрофотометре СФ-46 проводят в
условиях, рекомендованных технической документацией к прибору и
настоящими Методическими указаниями.
9. Подготовка к выполнению измерений и проведение измерений
Перед выполнением измерений проводят следующие работы:
приготовление реактивов, подготовка спектрофотометра к работе,
установление градуировочной характеристики, отбор проб.
9.1. Приготовление растворов
Исходный раствор протеазы для градуировки (с = 1 мг/куб. см). В
мерную колбу емкостью 25 куб. см вносят 26,3 мг (95% основного
вещества), доводят 2 Н раствором гидроокиси натрия до метки и
тщательно перемешивают. Срок хранения исходного раствора 6 часов.
Рабочий раствор протеазы для градуировки (с = 100 мкг/куб. см).
В мерную колбу емкостью 25 куб. см помещают 2,5 куб. см исходного
раствора, доводят 2 Н раствором гидрооксида натрия до метки и
тщательно перемешивают. Срок хранения рабочего раствора 6 часов.
0,1 Н раствор гидрооксида натрия. В колбу емкостью 1000 куб. см
помещают 4,0 г гидрооксида натрия, приливают дистиллированную воду
до метки и тщательно перемешивают до полного растворения.
2 Н раствор гидрооксида натрия. В колбу емкостью 1000 куб. см
помещают 80,0 г гидроокиси натрия, приливают дистиллированную воду
до метки и тщательно перемешивают до полного растворения.
Рабочий раствор N 1. В колбу емкостью 100 куб. см помещают 10,0
г углекислого натрия, 0,2 г калий-натрий тартрата, 0,05 г серно-
кислой меди, приливают дистиллированную воду до метки и тщательно
перемешивают.
Исходный раствор реактива Фолина. В круглодонную колбу емкостью
1000 куб. см помещают 50,0 г натрия вольфрамово-кислого, 12,5 г
натрия молибденово-кислого, добавляют 360 куб. см дистиллированной
воды и перемешивают до полного растворения реактивов. К
полученному раствору добавляют 25 куб. см 85% раствора
ортофосфорной кислоты, 50 куб. см концентрированной соляной
кислоты и смесь кипятят в течение 10 ч с обратным холодильником.
Затем добавляют 76 г лития серно-кислого, 25 куб. см
дистиллированной воды и 3 капли брома. Кипятят под тягой без
обратного холодильника для удаления остатка брома. Охлаждают до
комнатной температуры и доводят дистиллированной водой до объема
500 куб. см, перемешивают и фильтруют. Из фильтрата отбирают 1
куб. см, добавляют 9 куб. см дистиллированной воды и титруют 0,1 н
раствором гидрооксида натрия по фенолфталеину. Реактив Фолина с
установленным титром доводят дистиллированной водой до 1 н
концентрации. Раствор хранят в темной склянке с притертой пробкой
в холодильнике. Срок хранения реактива - 1 месяц.
Рабочий раствор реактива Фолина готовят перед употреблением
путем разбавления 1 куб. см исходного раствора реактива Фолина
дистиллированной водой до объема 8 куб. см в расчете на одну
пробу.
9.2. Подготовка спектрофотометра к работе
Подготовку спектрофотометра к работе проводят в соответствии с
инструкцией по эксплуатации.
9.3. Установление градуировочной характеристики
Градуировочную характеристику устанавливают на градуировочных
растворах. Она выражает зависимость оптической плотности растворов
от массы субтилизина (протеазы) и устанавливается по 5 сериям
растворов для градуировки.
Каждую серию, состоящую из 6 растворов, готовят в пробирках с
притертыми пробками. Для этого в них вносят рабочий раствор
протеазы и 2 Н раствор гидрооксида натрия в соответствии с
таблицей. После этого в каждую пробирку приливают 2,0 куб. см
рабочего раствора N 1, тщательно перемешивают и выдерживают в
течение 10 мин. Затем добавляют 8 куб. см рабочего раствора
реактива Фолина, перемешивают и нагревают на водяной бане при
температуре 50 -С в течение 5 мин. После быстрого охлаждения
замеряют оптическую плотность растворов в кювете с толщиной
оптического слоя 2,0 мм при длине волны 650 нм по отношению к
раствору N 1 в таблице. Строят градуировочную характеристику,
нанося на ось ординат значения оптических плотностей
градуировочных растворов, а на ось абсцисс - соответствующие им
величины содержания протеазы. Градуировку проверяют 1 раз в 3
месяца или в случае использования новой партии реактивов.
Таблица
РАСТВОРЫ ДЛЯ УСТАНОВЛЕНИЯ ГРАДУИРОВОЧНОЙ ХАРАКТЕРИСТИКИ
ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ КОНЦЕНТРАЦИИ СУБТИЛИЗИНА (ПРОТЕАЗЫ)
------------------------------T----T-----T-----T-----T-----T-----¬
¦ Номер раствора ¦ 1 ¦ 2 ¦ 3 ¦ 4 ¦ 5 ¦ 6 ¦
+-----------------------------+----+-----+-----+-----+-----+-----+
¦Объем рабочего раствора ¦0 ¦0,1 ¦0,2 ¦0,5 ¦0,8 ¦1,0 ¦
¦протеазы, куб. см ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+-----------------------------+----+-----+-----+-----+-----+-----+
¦Объем раствора 2 Н гидроокиси¦1,0 ¦0,9 ¦0,8 ¦0,5 ¦0,2 ¦- ¦
¦натрия, куб. см ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+-----------------------------+----+-----+-----+-----+-----+-----+
¦Содержание протеазы, мкг ¦0 ¦10,0 ¦20,0 ¦50,0 ¦80,0 ¦100,0¦
L-----------------------------+----+-----+-----+-----+-----+------
9.4. Отбор проб
Отбор проб воздуха, содержащего субтилизин (протеазу), проводят
согласно ГОСТ 17.2.3.01-86. Воздух аспирируют с помощью
электроаспиратора через фильтр со скоростью 200 куб. дм/мин. в
течение 30 мин. Отобранные пробы помещают в пробирки с притертыми
пробками.
Срок хранения - 3 дня.
10. Выполнение измерений
Фильтр с отобранной пробой помещают в бюкс, заливают 3 куб. см
2 Н раствора гидрооксида натрия и оставляют на 10 - 15 мин.,
периодически помешивая стеклянной палочкой. Степень десорбции
протеазы с фильтра 98%. Фильтр отжимают и отбрасывают. Для анализа
отбирают 1,0 куб. см полученного раствора и далее проводят анализ
в условиях, описанных в п. 9.3.
Расчет содержания субтилизина (протеазы) проводят по
градуировочной характеристике.
11. Вычисление результатов измерений
Концентрацию субтилизина (протеазы) в атмосферном воздухе
(мг/куб. м) вычисляют по формуле:
m х V
С = -------,
V х V
1 0
где:
m - содержание субтилизина (протеазы) в анализируемом объеме
пробы, мкг;
V - общий объем пробы, куб. см;
V - объем пробы, взятой для анализа, куб. см;
1
V - объем воздуха, взятого для анализа и приведенный к
0
нормальным условиям, куб. дм;
V х 273 х Р
V = ---------------,
0 (273 + t) х 760
где:
V - объем воздуха, взятого для анализа, куб. дм;
Р - атмосферное давление, мм рт. ст.;
Т - температура воздуха в месте отбора пробы, -С.
12. Оформление результатов измерений
Результаты измерений концентраций субтилизина (протеазы)
оформляют протоколом в виде: С, мг/куб. м; ДЕЛЬТА +/- 21% с
указанием даты проведения анализа, места отбора пробы, названия
лаборатории, юридического адреса организации, ответственного
исполнителя и руководителя лаборатории.
13. Контроль погрешности измерений
Контроль погрешности измерений содержания субтилизина
(протеазы) проводят на градуировочных растворах в соответствии с
п. п. 10 и 11. Рассчитывают среднее значение результатов измерения
содержания протеазы в градуировочных растворах:
_ 1 n
С = - (SUM С ),
i n i=1 ni
где:
n - число измерений вещества в пробе градуировочной смеси;
C - результат измерения концентрации вещества в i-ой пробе
ni
градуировочного раствора, мкг/куб. дм.
Рассчитывают среднее квадратичное отклонение измерения
концентрации:
_______________
/ n _ 2
/ SUM (С - С )
/ i=1 ni i
S = \/ ---------------.
n - 1
Рассчитывают доверительный интервал:
_ S
ДЕЛЬТА С = --- х t,
i _
\/n
где:
t - коэффициент нормированных отклонений, определяемый по
табл. Стьюдента, при доверительной вероятности 0,95, и затем
относительную погрешность определения концентраций:
_
ДЕЛЬТА С
i
дельта = --------- х 100, %.
_
С
i
Если дельта <= 21%, то погрешность измерений
удовлетворительная. Если данное условие не выполняется, то
выясняют причину и повторяют измерения.
|
