|
Стр. 1
УТВЕРЖДАЮ
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей и
благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
31 мая 2007 г.
Дата введения:
1 августа 2007 г.
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ХОЛЕРЫ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
МУК 4.2.2218-07
1. Разработаны: Федеральной службой по надзору в сфере защиты
прав потребителей и благополучия человека (Ю.М.Федоров,
Н.Я.Жилина); Федеральным государственным учреждением
здравоохранения "Ростовский-на-Дону научно-исследовательский
противочумный институт" (Ю.М.Ломов, Б.Н.Мишанькин,
Л.С.Подосинникова, Л.Г.Воронежская, И.Я.Черепахина, Т.А.Кудрякова,
Б.Л.Мазрухо, Л.М.Смоликова, И.В.Рыжко, Р.И.Цураева,
Э.А.Москвитина, Б.П.Голубев, С.О.Водопьянов, Е.В.Монахова,
В.Д.Кругликов, Н.Р.Телесманич, А.Б.Мазрухо, В.В.Агафонова);
Федеральным государственным учреждением здравоохранения
"Противочумный Центр" (А.А.Кюрегян, С.М.Иванова, Ю.С.Королев);
Федеральным государственным учреждением здравоохранения
"Российский научно-исследовательский противочумный институт
"Микроб" (А.К.Адамов, З.В.Малыхина, Т.В.Бугоркова, Н.И.Смирнова,
Л.Ф.Ливанова; А.В.Топорков, С.И.Заднова, Н.А.Осина, Е.С.Казакова,
Н.Б.Челдышева, А.В.Осин); Федеральным государственным учреждением
здравоохранения "Иркутский научно-исследовательский противочумный
институт" (А.С.Марамович, В.С.Ганин, Л.Я.Урбанович, В.И.Погорелов,
Л.В.Миронова, Е.С.Куликалова); Федеральным государственным
учреждением здравоохранения "Ставропольский
научно-исследовательский противочумный институт" (В.Н.Савельев);
Федеральным государственным учреждением здравоохранения
"Причерноморская противочумная станция" (Г.В.Гальцева);
Государственным Центром по антибиотикам (С.В.Сидоренко);
Российской медицинской академией последипломного образования
(Е.А.Ведьмина); ГИСК им. Л.А.Тарасевича (Т.И.Анисимова,
Л.В.Саяпина).
2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в
сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным
государственным санитарным врачом Российской Федерации
Г.Г.Онищенко 31 мая 2007 г.
3. Введены взамен методических указаний "Лабораторная
диагностика холеры" МУ 4.2.1097-02.
1. Область применения
1.1. Методические указания "Лабораторная диагностика холеры"
разработаны для внедрения и применения действующих нормативных
документов, определяющих требования к эпидемиологическому надзору
за холерой в части, касающейся организации и проведения
лабораторной диагностики холеры.
1.2. Настоящие методические указания предназначены для
специалистов бактериологических лабораторий учреждений,
осуществляющих государственный санитарно-эпидемиологический
надзор, лечебно-профилактических и противочумных учреждений.
2. Нормативные ссылки
2.1. Санитарно-эпидемиологические правила "Порядок выдачи
санитарно-эпидемиологического заключения о возможности проведения
работ с возбудителями инфекционной заболеваемости человека I-IV
групп патогенности (опасности), генно-инженерно-модифицированными
микроорганизмами, ядами биологического происхождения и
гельминтами. СП 1.2.1318-03".
2.2. Санитарно-эпидемиологические правила "Безопасность работы
с микроорганизмами I-II групп патогенности. СП 1.3.1285-03".
2.3. Санитарные правила "Порядок учета, хранения, передачи и
транспортирования микроорганизмов I-IV групп патогенности. СП
1.2.036-95".
2.4. Санитарные правила "Безопасность работы с
микроорганизмами III-IV групп патогенности и гельминтами. СП
1.2.731-99".
2.5. Санитарные правила "Условия транспортировки и хранения
медицинских иммунобиологических препаратов. СП 3.3.2.028-95".
2.6. Методические указания "Организация работ при
исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного
микроорганизмами I-II групп патогенности. МУ 1.3.1794-03".
2.7. Санитарные правила "Профилактика холеры. Общие требования
к эпидемиологическому надзору. СП 3.1.1086-02".
3. Характеристика возбудителя холеры
Холера - острая инфекционная болезнь с диарейным синдромом,
фекально-оральным механизмом заражения, пищевым, водным и
контактно-бытовым путями распространения возбудителя. Относится к
группе инфекций, борьба с которыми регламентируется Международными
медико-санитарными правилами (2005).
Возбудителями холеры являются холерные вибрионы O1
(классического и эльтор биоваров) и O139 серогрупп.
+
Токсигенные (ctx ) холерные вибрионы обеих серогрупп вызывают
заболевание холерой, склонное к эпидемическому и пандемическому
распространению (эпидемически значимые штаммы), нетоксигенные
-
(ctx ) - единичные или групповые заболевания холерой при общем
источнике заражения.
-
У нетоксигенных (ctx ) штаммов холерных вибрионов возможно
присутствие отдельных генов патогенности, среди которых
определенную значимость имеет ген tcp, участвующий в реализации
процесса адгезии.
Характеристика генома выделенных холерных вибрионов
биологическими методами широко используется для
эпидемиологического анализа и оценки эпидемической значимости
выделенных штаммов.
4. Организация лабораторных исследований
Диагностические исследования на холеру в регламентированном
объеме могут проводить:
- бактериологические лаборатории учреждений, осуществляющих
государственный санитарно-эпидемиологический надзор,
лечебно-профилактических и противочумных учреждений, имеющие
разрешение на работу с микроорганизмами III группы патогенности;
- лаборатории особо опасных инфекций центров гигиены и
эпидемиологии Роспотребнадзора и ведомств, имеющие разрешение на
проведение диагностических исследований на холеру;
- лаборатории противочумных учреждений, имеющие разрешение на
проведение диагностических исследований на холеру и на работу с
возбудителем холеры.
Организация и выполнение диагностических исследований на
холеру в лабораториях должны осуществляться в соответствии с
требованиями, регламентирующими:
- безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп
патогенности - для бактериологических лабораторий учреждений,
осуществляющих государственный санитарно-эпидемиологический
надзор, и лечебно-профилактических учреждений;
- безопасность работы с микроорганизмами I-II групп
патогенности - для лабораторий (отделов) особо опасных инфекций
центров гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, ведомств и
противочумных учреждений;
- порядок учета, хранения, передачи и транспортирования
микроорганизмов IV группы патогенности.
Порядок получения лабораториями разрешения на диагностические
исследования на холеру определяется действующими нормативными
документами о порядке выдачи разрешений на эти виды работ.
В условиях осложнения эпидемиологической обстановки временное
разрешение на проведение диагностических исследований на холеру
бактериологическим лабораториям учреждений, осуществляющих
государственный "санитарно-эпидемиологический надзор, и другим,
функционирующим в составе лабораторной службы очага, в случае,
расширения функциональных обязанностей представляется решением
медицинского штаба очага.
4.1. При осуществлении эпидемиологического надзора
4.1.1. Бактериологические лаборатории учреждений,
осуществляющих государственный санитарно-эпидемиологический
надзор, и лечебно-профилактические учреждения проводят плановые
диагностические исследования на холеру материала от больных
острыми кишечными инфекциями, определенного контингента здоровых
лиц и проб из объектов окружающей среды в объеме, предусмотренном
действующими нормативными документами по эпидемиологическому
надзору за холерой.
Исследования ведут до установления отрицательного результата
анализа или до выделения культуры с характерным для вибрионов
ростом на агаровой и полиуглеводной средах и положительной
реакцией на оксидазу. Культуры проверяют на чистоту в мазке,
окрашенном по Граму, на подвижность и в реакции агглютинации на
стекле (далее слайд-агглютинации) с холерными сыворотками O1,
Огава, Инаба, PO и O139.
При положительном результате слайд-агглютинации немедленно
сообщают в органы Роспотребнадзора в субъекте Российской
Федерации, культуру для окончательной идентификации немедленно
доставляют в специализированную лабораторию в установленном
порядке.
При отрицательном результате слайд-агглютинации:
- неагглютинирующиеся холерными сыворотками O1 и O139
культуры, выделенные от людей, направляют для дальнейшей
идентификации в специализированную лабораторию;
- неагглютинирующиеся холерными сыворотками O1 и O139
культуры, выделенные из объектов окружающей среды, идентифицируют
на месте или по согласованию передают в учреждение
Роспотребнадзора.
4.1.2. Лаборатории особо опасных инфекций центров гигиены и
эпидемиологии Роспотребнадзора и ведомств:
- выполняют диагностическое исследование материала от больных
и умерших с подозрением на холеру и проб из объектов окружающей
среды;
- идентифицируют культуры вибрионов, выделенных в
территориальных и ведомственных лабораториях, определяя их
таксономическую принадлежность, а также определяют эпидемическую
значимость (токсигенность) и антибиотикочувствительность холерных
вибрионов O1 и O139 серогрупп по регламентированным для этих
лабораторий тестам;
- осуществляют (или организуют) бактериологический контроль
качества питательных сред и других диагностических препаратов,
используемых в территориальных лабораториях;
- представляют оперативную информацию о выделении культур
холерных вибрионов O1 и O139 серогрупп;
- в установленном порядке немедленно передают в
территориальное противочумное учреждение культуры холерных
вибрионов, таксономическая принадлежность или токсигенность
которых имеющимися средствами диагностики не определяется;
- в течение 5 дней после окончания идентификации передают в
территориальное противочумное учреждение или в головной по
проблеме "Холера" Ростовский-на-Дону научно-исследовательский
противочумный институт все культуры холерных вибрионов O1, O139,
независимо от объекта обследования, и других серогрупп при
выделении от больных;
- контролируют деятельность территориальных лабораторий,
оказывают им методическую помощь по всем вопросам лабораторного
обеспечения эпидемиологического надзора за холерой.
4.1.3. Лаборатории противочумных учреждений:
- проводят исследования материала от больных и умерших с
подозрением на заболевание холерой, а также проб из объектов
окружающей среды;
- подтверждают таксономическую принадлежность культур холерных
вибрионов, выделенных на курируемой территории;
- идентифицируют все атипичные культуры холерных вибрионов с
использованием дополнительных методов серологической,
биохимической и других видов идентификации с целью уточнения
таксономической принадлежности;
- определяют эпидемическую значимость (токсигенность) и
антибиотикочувствительность культур;
- осуществляют методическое руководство по всем вопросам
лабораторного обеспечения эпидемиологического надзора за холерой
на курируемой территории;
- в установленном порядке выделенные культуры холерных
вибрионов с паспортами передают в территориальный противочумный
институт, головной по проблеме "Холера" Ростовский-на-Дону
научно-исследовательский противочумный институт, одновременно
паспорта на эти же культуры направляют в противочумный центр
Роспотребнадзора.
Лабораторное обеспечение эпидемиологического надзора за
холерой осуществляют в соответствии с действующими нормативными и
методическими документами. Профилактические исследования на холеру
проводят в течение рабочего дня с использованием соответствующих
питательных сред, диагностические исследования материала от
подозрительных на холеру больных (трупов) - в условиях
круглосуточного режима работы лаборатории.
4.2. При проведении противоэпидемических
мероприятий
Организация и регламентирование деятельности лабораторий, а
также формирование лабораторной службы в очаге холеры
осуществляются в соответствии с действующими нормативными
документами по организации и проведению противохолерных
мероприятий.
5. Бактериологическое исследование
В системе противохолерных мероприятий значительное место
занимает бактериологический анализ, от правильности и
своевременности проведения которого зависит характер и объем
профилактических и противоэпидемических мероприятий.
Исследования проводят с целью:
- выявления больных холерой и вибриононосителей;
- установления окончательного диагноза при вскрытии трупов
лиц, умерших от подозрительного на холеру заболевания;
- обоснования выбора средств этиотропной терапии холеры;
- бактериологического контроля эффективности лечения больных
холерой и вибриононосителей;
- бактериологического контроля объектов окружающей среды, в
том числе поверхностных водоемов;
- бактериологического контроля эффективности обеззараживания в
очаге инфекции.
5.1. Отбор и доставка материала на исследование
Материалом для бактериологического анализа могут служить
испражнения, рвотные массы, желчь, трупный материал (отрезки
тонкого кишечника и желчный пузырь); предметы, загрязненные
испражнениями (постельное и нательное белье и др.); вода, ил,
гидробионты, сточные воды, содержимое выгребных туалетов; смывы с
объектов окружающей среды, пищевые продукты, мухи и др.
Материал от больного забирает медицинский персонал лечебного
учреждения, немедленно после выявления больного и до начала
лечения антибиотиками. Руководитель является ответственным за
правильность отбора, хранения и своевременность доставки проб в
лабораторию.
Необходимо учитывать высокую чувствительность холерных
вибрионов к дезинфицирующим средствам и кислотам, возможность
антагонистического действия сопутствующей микрофлоры и
предполагаемую концентрацию возбудителя в исследуемом материале.
Если в материале от больных алгидной формой холеры концентрация
6 9
возбудителя достигает 10 -10 м.к./мл, то в испражнениях больных
легкой формой и леченных антибиотиками, реконвалесцентов и
носителей количество холерных вибрионов обычно не превышает
2 4
10 -10 м.к./г.
Для отбора проб используют чистую стерильную посуду, не
содержащую следов дезинфицирующих растворов. Стерилизацию посуды и
других средств забора материала проводят автоклавированием, сухим
жаром или кипячением в 2%-м растворе пищевой соды.
Материал для исследования должен быть доставлен не позже, чем
через 2 ч. после его взятия. В случае удлинения сроков доставки
используют транспортные среды. Наиболее удобной и достаточно
эффективной является 1%-я пептонная вода (pH 8,4 +/- 0,1).
В пептонную воду в качестве ингибитора сопутствующей флоры
может быть добавлен теллурит калия из расчета 1:100000-1:200000
или моющее средство "Прогресс" в концентрации 0,1-0,2%. В
отдельных случаях для транспортирования материала могут быть
использованы солевые консерванты (см. раздел 7).
На флаконах (пробирках) с пептонной водой, передаваемых в
стационары для отбора проб, должна быть этикетка или надпись с
указанием названия среды и даты ее приготовления.
Среды во флаконах или пробирках, закрытых ватно-марлевыми
пробками, рекомендуется хранить не более 2-х суток при температуре
не выше (10,0 +/- 0,2) град. C при условии сохранения их
стерильности. Целесообразно обеспечение стационаров и групп забора
проб средами в закатанных флаконах.
При наличии у больного диареи материал забирают до начала
этиотропной терапии в количестве 10-20 мл, у больных легкими
формами - 1-2 г испражнений. От больных тяжелой формой материал
направляют в лабораторию нативным и в 1%-й пептонной воде. В
транспортную среду вносят 1-2 мл или 1-2 г материала на 5-6 мл
среды.
При вынужденном удлинении сроков доставки материала в
лабораторию (длительное плавание, круиз и т.п.) можно использовать
полоски фильтровальной (промокательной) бумаги. Жидкими
испражнениями пропитывают полоску обычной плотной промокательной
бумаги или другого гигроскопичного материала и герметично
упаковывают в пластиковый пакет для предохранения от высыхания при
транспортировании в лабораторию. На таких полосках холерные
вибрионы выживают до четырех-пяти или более недель, пока
сохраняется влага.
При обследовании на вибриононосительство материал забирает
медицинский персонал лечебно-профилактических учреждений, в очаге
создают специальные группы по отбору проб, работающие под
руководством эпидемиологов.
Материал в количестве 1-2 г может быть доставлен на
исследование нативным, в 1%-й пептонной воде или другой
транспортной среде.
5.1.1. Способы отбора проб от больных холерой,
вибриононосителей и контактных с ними лиц, секционного материала
Испражнения и рвотные массы в количестве 10-20 мл собирают в
стерильную посуду стерильными ложками или стеклянными трубками с
резиновой грушей из индивидуального судна, на дно которого
помещают меньший по размеру сосуд (лоток), удобный для
обеззараживания кипячением.
Для взятия материала у больных с обильным водянистым стулом
можно использовать резиновый катетер, один конец которого вводят в
прямую кишку, а другой опускают в банку. Жидкие испражнения
стекают в сосуд свободно или при легком массаже брюшной стенки.
Стерильный ректальный ватный тампон из гигроскопической ваты
вводят в прямую кишку на глубину 5-6 см, собирают им содержимое со
стенок кишечника и опускают во флакон или пробирку с 1%-й
пептонной водой.
Стандартную стерильную петлю из алюминиевой проволоки перед
забором материала смачивают стерильным 0,9%-м раствором натрия
хлорида и вводят в прямую кишку на 5-6 см. Взятый материал
переносят во флакон или пробирку с 1%-й пептонной водой.
Желчь берут при дуоденальном зондировании в лечебном
учреждении. В отдельные пробирки собирают две порции: из желчного
пузыря и желчных протоков (B и C). Материал доставляют нативным.
От умерших с подозрением на холеру берут отрезки (длиной около
10 см) верхней, средней и нижней частей тонкой кишки, разрез
производят между двойными лигатурами, предварительно наложенными
на оба конца изымаемого участка кишечника. Желчный пузырь после
перевязки протока извлекают целиком. Содержимое кишечника и желчь
от трупа можно взять стерильным шприцем с толстой иглой в объеме
до 10 мл и перенести в емкость с 1%-й пептонной водой. Взятые
образцы органов трупа укладывают раздельно в стерильные банки.
Банки, пробирки с материалом закрывают непромокаемыми пробками
и пергаментной бумагой, тщательно обрабатывают снаружи салфеткой,
смоченной дезинфицирующим раствором, избегая затекания его внутрь.
Все пробы этикетируют, укладывают в специально подготовленную для
транспортирования металлическую тару и перевозят на служебном
транспорте с сопровождающим. Форма направления дана в прилож. 1.
5.1.2. Отбор проб из объектов окружающей среды
Воду (питьевую, из поверхностных водоемов и др.) для
исследования берут в количестве 1 л на одну пробу в двух объемах
по 500 мл в стерильную посуду с непромокаемой пробкой.
Из водопроводных кранов пробы воды берут после
предварительного обжигания их спиртовым факелом и спуска воды в
течение 10 мин. при полном открытии крана.
Хозяйственно-бытовые сточные воды отбирают для исследования
двумя способами: в объеме 1 л в двух емкостях по 500 мл или
тампонами, приготовленными из марлевых салфеток размером 10x10 см,
сложенных в 10-15 слоев. Последние закрепляют у места забора воды,
через сутки помещают в стерильную банку и доставляют в
лабораторию.
Гидробионтов (рыб, лягушек и др.) отлавливают из водоемов
любым способом и в закрытых банках, ведрах и других сосудах
доставляют в лабораторию.
Ил и фитопланктон (водоросли) также помещают в стерильные
банки и транспортируют в лабораторию.
Исследовать зоопланктон (дафнии, циклопы и др.) можно
групповым методом, объединяя в один посев 10-30 образцов,
отловленных на одном участке водоема. В этом случае они могут быть
доставлены в одном сосуде. При исследовании рыб берут содержимое
желудка и жабры.
Смывы с различных объектов окружающей среды берут ватным или
марлевым тампоном, смоченным 0,9%-м раствором натрия хлорида, с
поверхности площадью 10x10 см. Тампон опускают во флакон или
пробирку с 1%-й пептонной водой.
Для сбора мух расставляют мухоловки, в которые наливают 1%-ю
пептонную воду с 1% сахара.
Остатки пищи в очаге и по показаниям пищевые продукты отбирают
по 200 г плотных и 0,5 л жидких, помещают в стеклянную посуду и
закрывают. При необходимости в жидкие продукты добавляют основной
пептон до 1%-й концентрации.
Пробы объектов окружающей среды этикетируют, заполняют
направление (прилож. 2) и отправляют в лабораторию с нарочным
согласно действующим СП.
Перечень предметов, входящих в укладки для отбора проб, см. в
прилож. 3, 4.
5.2. Порядок исследования
При бактериологическом исследовании на холеру используют
различные питательные среды: жидкие среды обогащения, щелочной
агар, элективные дифференциально-диагностические среды и набор
сред для идентификации.
Применяют сухие среды производственного выпуска, имеющие
номера госрегистрации и лицензии, или среды, консерванты,
приготовленные по рецептуре и технологии, изложенной в разделе 7.
Используемые для диагностики холеры питательные среды подлежат
бактериологическому контролю в установленном порядке.
Агаровые среды перед использованием должны быть тщательно
подсушены. Посев делают так, чтобы получить рост в виде
изолированных колоний. Все посевы инкубируют при температуре (37,0
+/- 0,5) град. C.
Посевы исследуемого материала на всех этапах выращивают в 1%-й
пептонной воде 6-8 ч., в пептонной воде с теллуритом калия - 12-18
ч., на щелочном агаре - не менее 14-16 ч., а на плотных элективных
средах - 18-24 ч. Теллурит калия следует добавлять в 1%-ю
пептонную воду с pH не ниже 8,3 +/- 0,1, до внесения исследуемого
материала. Продолжительность хранения рабочего раствора теллурита
калия (1:1000) - 7 дней, а питательных сред с теллуритом калия -
не более 2-х суток при условии содержания их в холодильнике.
5.2.1. Исследование проб от больных и
вибриононосителей, секционного материала (рис. 1)
I этап
Испражнения, рвотные массы больных, а также содержимое
кишечника, желчного пузыря и суспензию кусочков слизистой тонкого
кишечника трупа в объеме 0,5- 1,0 мл засевают пипеткой в 50-100 мл
накопительной среды, петлей - на щелочной агар и одну из
элективных сред (СЭДХ, TCBS).
При исследовании материала от больных с подозрением на
заболевание холерой не допускается использование в качестве
накопительной среды 1%-й пептонной воды с теллуритом калия.
В случае поступления материала от больных с подозрением на
холеру могут быть использованы ускоренные методы исследования:
иммунолюминесцентный, иммобилизация и ПЦР со специфическими
праймерами (см. раздел 6) на первом, втором и последующих этапах
исследования.
Материал от подозреваемых на вибриононосительство засевают в
50 мл среды накопления при индивидуальных анализах и в 100 мл -
при групповых, объединяя в один флакон по 0,5-1,0 мл пробы не
более чем от 5 человек. К групповым посевам прибегают в редких
случаях при проведении массовых обследований на
вибриононосительство.
Материал, доставленный в 5 мл 1%-й пептонной воды, полностью
используют для посева в 50 мл среды накопления. В случае
поступления в лабораторию материала, забранного в 50 мл 1%-й
пептонной воды во флаконе, и доставки его не позже 2-х ч. после
забора пробы, флакон помещают в термостат на 6 ч. для накопления
возбудителя. При доставке материала в более поздние сроки 5 мл его
засевают в 50 мл 1%-й пептонной воды.
В отдельных случаях, при бактериологическом исследовании
материала от лиц, принимавших антибиотики, активные по отношению к
возбудителю холеры, его засевают в 200-300 мл 1%-й пептонной воды
(предпочтительно в широкогорлые колбы) и на 2 чашки щелочного
агара так, чтобы получить рост в виде изолированных колоний.
Посевы инкубируют при 37 град. C в течение 24 ч., производя
последовательные высевы через 8-10 ч. инкубации с поверхностного
слоя среды на пластинки щелочного агара. Использование второй
среды обогащения в этом варианте исследования нецелесообразно.
II этап (через 6-8 ч. от начала исследования)
С первой среды накопления делают высев на щелочной агар и одну
из элективных сред и в 5-8 мл второй среды накопления. Пересевы в
жидкие и на плотные среды делают с поверхности жидкой среды
большой бактериологической петлей диаметром 5 мм.
При отрицательных результатах исследования нативного материала
ускоренными методами их повторяют после 6 ч. инкубации первой
среды накопления.
III этап (через 12-16 ч. от начала исследования)
Высев со второй среды накопления на щелочной агар.
В случае необходимости ускорения хода анализа материала от
больного, подозрительного на заболевание холерой, отбор колоний со
щелочного агара, засеянного в начале исследования, можно начинать
уже на этом этапе, в остальных случаях - на следующем.
IV этап (через 18-24 ч. от начала исследования)
Отбор подозрительных на холерный вибрион колоний в посевах на
плотные среды нативного материала, а также в высевах из 1-й и 2-й
накопительных сред.
Рис. 1. Схема лабораторного исследования на холеру
--------------------------------------------------------¬
¦ ИССЛЕДУЕМЫЙ МАТЕРИАЛ ¦
L--T--------T-------------------------------------T------
¦ ¦ ¦
¦ \/ ¦
\/ ----¬----------------------------> \/
---------¬ ¦ I ¦ -----¬ --------------------¬
¦ ЩА, ЭС ¦ ¦ +--->¦ II ¦------------------>¦ Ускоренные методы:¦
L-----T--- L-T-- L--T-- ¦ - МФА ¦
¦ \/ \/ ¦ - РИВ ¦
¦ ---------¬ -----¬ ¦ - РИГА ¦
¦ ¦ ЩА, ЭС ¦ ¦ ЩА ¦ ¦ - ПЦР ¦
¦ L----T---- L--T-- ¦ ¦
\/ \/ \/ ¦ ¦
-------------------------------------------¬ ¦ ¦
¦- отбор колоний ¦ ¦ ¦
¦- высев подозрительных колоний на ЩА и ПУС¦ ¦ ¦
L---------------------------T--------------- L--------------------
\/
---------------------------------------¬
¦ Отбор культур по ПУС и ОП ¦
L-------------------T-------------------
\/
--------------T------------T------------T----------------T---------¬
¦ \/ \/ \/ \/ \/
\/ ---------¬ --------¬ ------¬ -----¬ -----¬
------¬ ¦ПУС+ <*>¦ ¦ОП+ <*>¦ ¦ПУС- ¦ ¦ПУС-¦ ¦ПУС+¦
¦ПУС+ ¦ L--------- L-------- ¦ОП+ ¦ ¦ОП- ¦ ¦ОП- ¦
¦ОП+ ¦ L--T--- L-T--- L-T---
L--T--- ¦ \/ \/
L-----------------T---------------------- ----------¬ -----------¬
\/ ¦ Не ¦ ¦Исследуют ¦
¦исследуют¦ ¦на кишеч- ¦
+ -------------------------------------¬ - ¦ ¦ ¦ную группу¦
--+ ОРА с сыворотками O1 и O139 +----------¬ L---------- L-----------
¦ L------------------------------------- ¦
¦ ¦
\/ \/
----------------------------------------------¬-------------------------------¬
¦Сокращенная схема идентификации: ¦¦Определение принадлежности ¦
¦- морфология и подвижность микробных клеток ¦¦к роду Vibri, виду V. Cholerae¦
¦- ОП ¦¦или другим видам патогенных ¦
¦- O/F тест и отношение к отдельным углеводам ¦¦вибрионов ¦
¦и аминокислотам (табл. 4) ¦L-------------------------------
¦- МФА ¦
¦- РИВ ¦
¦- РА с сыворотками Ol, Инаба, Огава, PO или ¦
¦O139 ¦ ------------------------------¬
¦- чувствительность к фагам холерным ¦ ¦Условные обозначения: ¦
¦классическому и эльтор ¦ ¦I и II - среда накопления; ¦
¦- Ориентировочная оценка эпидемической ¦ ¦ЩА - щелочной агар; ¦
¦значимости: гемолитическая активность по ¦ ¦ЭС - элективная среда ¦
¦Грейгу чувствительность к фагам холерным ¦ ¦для выделения холерных ¦
¦ + - ¦ ¦вибрионов; ¦
¦эльтор ctx и ctx ¦ ¦ПУС - полиуглеводная среда; ¦
+---------------------------------------------+ ¦ОП - оксидазная проба; ¦
¦Дополнительные признаки биовара V. cholerae: ¦ ¦ОРА - ориентировочная ¦
¦- гемагглютинация; ¦ ¦реакция агглютинации; ¦
¦- чувствительность к полимиксину В 50 ЕД/мл ¦ ¦РА - развернутая реакция ¦
¦- реакция Фогес-Проскауэра ¦ ¦агглютинации; ¦
+---------------------------------------------+ ¦МФА - метод флюоресцирующих ¦
¦Определение антибиотикограммы ¦ ¦антител; ¦
¦Окончательная оценка эпидемической ¦ ¦РИВ - реакция ¦
¦значимости: ¦ ¦иммобилизации вибрионов; ¦
¦- ПЦР на наличие ctx АБ (A) и tcpA генов ¦ ¦РНГА - реакция непрямой ¦
¦- токсигенность на кроликах-сосунках ¦ ¦гемагглютинации; ¦
+---------------------------------------------+ ¦ПЦР - полимеразная цепная ¦
¦Уточнение родовой и видовой принадлежности ¦ ¦реакция; ¦
¦атипичных культур по расширенному набору ¦ ¦<*> - в случае отбора колоний¦
¦признаков (табл. 2, 3) ¦ ¦только на ПУС или ЩА. ¦
L---------------------------------------------- L------------------------------
а) Чашки с посевами просматривают в проходящем свете
невооруженным глазом или с помощью лупы, а также (особенно в
вечернее и ночное время) под стереоскопическим микроскопом в косо
проходящем свете и отбирают подозрительные на вибрионы колонии для
выделения и идентификации культуры.
На щелочном агаре колонии холерных вибрионов O1 и O139
серогрупп в типичной S-форме - круглые, гладкие, плоские,
голубоватые, гомогенные, с ровными краями, прозрачные в проходящем
свете и светло-серые с голубым или зеленоватым оттенком под
стереоскопическим микроскопом в косо проходящем свете (прилож. 5).
Колонии холерных вибрионов на элективных средах TCBS и СЭДХ
имеют ярко-желтую окраску на зеленом или синем фоне среды,
полупрозрачные. Размеры колоний на щелочном агаре через 10-12 ч.
инкубации обычно не превышают 1 мм, а к 18-24 ч. достигают 2-3 мм
в диаметре. Темпы формирования колоний холерных вибрионов на
элективных средах несколько замедлены, поэтому просмотр посевов на
СЭДХ или TCBS следует проводить не ранее чем через 18-20 ч.
инкубации, когда размеры их становятся близки к колониям,
вырастающим на щелочном агаре.
В отдельных случаях в посевах могут также встречаться
атипичные колонии: мутные с плотным центром, пигментированные
(коричневые или светло-желтые), мельчайшие коккоподобные,
шероховатые. Следует иметь в виду, что состав и качество
питательных сред оказывают влияние на величину и плотность колоний
холерных вибрионов, а также на морфологию клеток.
б) При отборе колоний можно использовать пробу на
индофенолоксидазу с однокомпонентным реактивом (без альфа-нафтола)
с индикаторными бумажками из набора СИБ-1 для идентификации
вибрионов или - тест-системы ОКСИ-тест. С колониями, обнаруженными
на элективных средах, пробу на оксидазу ставить не рекомендуется.
в) Подозрительные колонии проверяют в слайд-агглютинации с
сывороткой холерной O1 в разведении 1:50-1:100. При положительной
реакции и достаточном количестве подозрительных колоний ставят
слайд-агглютинацию с вариантоспецифическими сыворотками Инаба и
Огава в том же разведении, приготавливают мазки для окраски по
Граму и обработки флюоресцирующими иммуноглобулинами. При
отрицательных результатах колонии, обнаруженные в посевах
материала от больных, проверяют в слайд-агглютинации с холерными
сыворотками O139 и PO.
Положительная ориентировочная реакция агглютинации с холерной
Ol сывороткой в разведении 1:100 и вариантоспецифической в
разведении 1:50 или положительная реакция с флюоресцирующими
иммуноглобулинами в сочетании с морфологическими, культуральными
признаками и специфической иммобилизацией позволяют выдать на
соответствующем этапе предварительный ответ об обнаружении в
исследуемом материале холерного вибриона O1, а в случае
положительной реакции с сывороткой O139 - холерного вибриона O139
серогруппы.
г) Подозрительные на вибрионы колонии, агглютинирующиеся и не
агглютинирующиеся холерными O1 и O139 сыворотками, отсевают на
одну из полиуглеводных сред (лактозо-сахарозная, Ресселя,
Клиглера, маннозо-сахарозная или др.) и (или) на сектор пластинки
щелочного агара для выделения чистой культуры, ее идентификации и
определения чувствительности к антибиотикам.
V этап (через 24-36 ч. от начала исследования)
Отбор культур для идентификации
На полиуглеводных средах отбирают культуры с типичными для
вибрионов характером роста и изменениями:
- на двууглеводных средах (лактозо-сахарозная,
глюкозо-лактозная и Клиглер) наблюдается характерное для кислой
реакции изменение цвета столбика при сохранении цвета скошенной
части без образования газа, а также сероводорода, продуцируемого в
среде Клиглера, отдельными штаммами за счет расщепления
серосодержащихся компонентов;
- в маннозо-сахарозной среде за счет ферментации обоих
углеводов окрашиваются и столбик, и скошенная часть, а также в
отдельных случаях улавливается образование сероводорода.
Культуры, выросшие на щелочном агаре, проверяют на наличие
индофенолоксидазы.
Определяют морфологию микроорганизмов и чистоту отобранных
культур, выросших на щелочном агаре и полиуглеводных средах, с
помощью окрашенных по Граму мазков.
Культуры, дающие характерные изменения на полиуглеводных
средах и положительные в пробе на оксидазу, проверяют в
ориентировочной слайд-агглютинации с холерными сыворотками O1 в
разведении 1:100, PO, Инаба и Огава - в разведении 1:50. При
отрицательных результатах с этими сыворотками ставят
слайд-агглютинацию с холерной сывороткой O139 серогруппы,
используя ее в соответствии с инструкцией по применению.
На основании положительных результатов агглютинации с
сыворотками O1, Инаба или/ и Огава выдают предварительный
положительный ответ о выделении из исследуемого материала культуры
холерного вибриона O1 соответствующего серовара.
Если выделенная культура реагирует с холерной сывороткой O139
при отрицательных результатах с сыворотками O1 серогруппы, выдают
ответ о выделении холерного вибриона O139 серогруппы.
Проводят идентификацию выделенных на полиуглеводных средах или
на щелочном агаре агглютинирующихся и не агглютинирующихся
сыворотками O1, PO или O139 серогрупп оксидазопозитивных культур
по сокращенной или полной схеме, не агглютинирующихся холерными
O1, PO и O139 сыворотками - до определения вида с учетом основных
родовых признаков.
VI этап (через 36-48 ч. от начала исследования)
Учитывают результаты идентификации и выдают окончательный
ответ о выделении культуры холерного вибриона соответствующей
серогруппы и биовара.
Для холерных вибрионов O1 эпидемическую значимость
ориентировочно оценивают по тестам гемолитической активности и
+ -
чувствительности к фагам эльтор ctx и ctx , а в
специализированных учреждениях - окончательно по результатам ПЦР
или генетического зондирования на присутствие в геноме выделенной
культуры ctx AB (A) гена, а также токсигенности на модели
кроликов-сосунков. Эпидемическую значимость холерных вибрионов
O139 серогруппы определяют по тем же тестам, кроме
+ -
чувствительности к фагам эльтор ctx и ctx . К окончанию этого
этапа исследования должна быть определена
антибиотикочувствительность выделенной культуры.
При выделении от больного или вибриононосителя культуры
холерного вибриона, не агглютинирующейся холерными сыворотками O1
и O139, выдают ответ о выделении холерных вибрионов не O1 и не
O139. При наличии вибрионных агглютинирующих диагностических
сывороток определяют принадлежность к другим серогруппам (O2-O83).
Идентификацию культур, агглютинирующихся PO-сывороткой, см. в
разделе 5.3.
5.2.2. Исследование объектов окружающей среды
Схема анализа объектов окружающей среды отличается от схемы
исследования материала от больных только на I этапе, II-VI этапы
изложены выше.
а) Вода поверхностных водоемов и водопроводная
В зависимости от времени доставки пробы возможны следующие
варианты посевов с целью первичного накопления вибрионов:
- к исследуемой воде добавляют раствор основного пептона до
1%-й концентрации, определяют pH, в случае необходимости
подщелачивают 10%-м раствором едкого натрия до pH 8,4 +/- 0,1.
Время инкубации в 1-й среде накопления - 8-10 ч. Объем 2-й среды
накопления - 10 мл; время инкубации в среде без теллурита калия -
6 ч., а с теллуритом калия - 18-20 ч.;
- в исследуемую воду добавляют раствор основного пептона до
1%-й концентрации и теллурит калия из рабочего разведения 1:1000
до концентрации 1:100000 или 1:200000 в соответствии с данными
проверки. Устанавливают pH 8,4 +/- 0,1. Время инкубации 18-24 ч.;
вторая среда накопления - 10 мл среды без теллурита калия, время
инкубации 6-8 ч.;
- исследование проб воды можно также проводить с
использованием в качестве ингибитора посторонней флоры моющего
средства "Прогресс" в концентрации 0,1- 0,2%; после добавления
основного раствора пептона до 1%-й концентрации и установления
щелочной реакции пробы сохраняют при комнатной температуре (не
выше 25 град. C) до утра (первая среда накопления). В начале
следующего дня засевают 5 мл поверхностного слоя в 100 мл 1%-й
пептонной воды (вторая среда накопления) и делают высев на
щелочной агар; высев со второй среды накопления производят через
6-8 ч. инкубации;
- воду фильтруют через мембранные фильтры N 2 или 3, смыв с
которых сеют в накопительную среду и на агаровые пластинки. Из
смыва с фильтра можно делать мазки для окраски флюоресцирующими
холерными иммуноглобулинами, а также ставить РИГА, ПЦР со
специфическими праймерами.
При интенсивном бактериальном загрязнении проб можно
использовать III среду накопления.
б) Хозяйственно-бытовые сточные воды
Сточные воды, доставленные в объеме 1 л, фильтруют через
бумажный или матерчатый фильтр для освобождения от механических
примесей (при необходимости).
После добавления к пробам основного раствора пептона до 1%-й
концентрации устанавливают pH 8,4 +/- 0,1 и инкубируют в объемах
по 500 мл 8-10 ч. (1 среда накопления) или с добавлением теллурита
калия 1:100000 (1:200000) - 18-24 ч.
При заборе сточных вод марлевыми тампонами последние помещают
в широкогорлые колбы или банки с накопительной средой (500 мл) и
далее исследуют, как указано выше.
в) Гидробионты
Лягушку непосредственно перед исследованием обездвиживают
уколом иглы в спинной мозг и фиксируют на препаровальной доске
брюшком вверх. Поверхность брюшка обрабатывают спиртом и ножницами
делают медиальный разрез. Желчный пузырь отсекают от печени,
разрезают и делают отпечаток на пластинке щелочного агара. Остатки
желчи вместе с желчным пузырем помещают во флаконы с 50-100 мл
1%-й пептонной воды. Содержимое желудка засевают в 1%-ю пептонную
воду, а внутренней поверхностью стенки делают отпечатки на
агаровые пластинки. Посев кишечника делают таким же образом,
отсекая несколько петель в верхнем, среднем и нижнем отделах
кишечника.
У крупных рыб в том же порядке засевают в накопительную среду
содержимое желчного пузыря, желудка, кишечника и жабры. Мелких рыб
(мальков) измельчают ножницами по 10-20 экз. в одной пробе и
делают посев суспензии петлей на чашку с агаром и в 1%-ю пептонную
воду.
Дафний, циклопов и других рачков, так же, как и фитопланктон,
растирают в ступке и засевают петлей в 1%-ю пептонную воду.
У раков исследуют кишечник и жабры, делая посев содержимого в
среду накопления и слизистой стенки - отпечатком на агаровую
среду.
г) Пищевые продукты
Безалкогольные напитки исследуют тем же методом, что и воду.
Молоко в количестве 5 мл сеют в 50-100 мл среды накопления или
к 0,5 л молока добавляют основной раствор пептона до 1%-й
концентрации его в молоке. Другие молочные продукты (кефир,
сметану, творог, мороженое и т.д.) в количестве 5-10 мл засевают в
1%-ю пептонную воду.
Из твердых пищевых продуктов берут навеску 25 г, растирают в
стерильной ступке с 2-3 г кварцевого песка и физиологическим
раствором, а затем переносят в 125 мл накопительной среды и петлей
на агаровые среды.
Масло засевают в жидкую среду накопления в количестве 5-10 г,
размягчив его в термостате, или делают посев смыва с поверхности
|
