|
Стр. 3
жидкости, доводят объем раствора водой до метки и проводят
определение.
Расчет содержания цинка в препаратах инсулина проводят по
градуировочной кривой.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНСЕРВАНТОВ В ГОРМОНАЛЬНЫХ ПРЕПАРАТАХ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФЕНОЛА
Метод броматометрического титрования. 5 мл препарата помещают
в коническую колбу вместимостью 150 мл с притертой пробкой,
прибавляют раствор 0,25 г калия бромида в 25 мл воды. 15 мл
(точный объем) раствора калия бромата (0,1 моль/л), 2,5 мл
разведенной серной кислоты перемешивают, закрывают колбу пробкой и
оставляют в темном месте на 15 мин. После этого к смеси прибавляют
1 г калия йодида, перемешивают, снова оставляют на 5 мин и титруют
раствором натрия тиосульфата (0,1 моль/л) (индикатор - крахмал).
Параллельно проводят контрольный опыт.
1 мл раствора натрия тиосульфата (0,1 моль/л) соответствует
0,001568 г фенола.
Содержание фенола в препарате в процентах (X) вычисляют по
формуле:
(а - б) х 0,001569 х 100
Х = --------------------------
в
где а - количество раствора натрия тиосульфата (0,1 моль/л),
пошедшее на титрование в контрольном опыте, в миллилитрах, б -
количество раствора натрия тиосульфата (0,1 моль/л), пошедшее на
титрование испытуемого препарата, в миллилитрах, в - количество
препарата, взятого для анализа, в миллилитрах.
Метод газовой хроматографии. Используют газовый хроматограф с
пламенно - ионизационным детектором, хроматографическая колонка
100х0,3 см, заполненная сорбентом с 5% полиэтиленгликоля 6000 или
20 М на промытом кислотой и силанизированном носителе "Хроматон N"
с размером частиц 0,125-0,250 мм (возможно применение других
носителей типа "Хромосорб", "Инертон" тех же квалификаций).
Температура колонки, узла ввода пробы, детектора 140, 200, 250
град. С соответственно. Скорость газа - носителя (азот) 20-50
мл/мин. Величина вводимой пробы (2-5 мкл) определяется
чувствительностью детектора.
Содержание фенола в препарате определяют методом абсолютной
калибровки или методом внутреннего стандарта, в качестве которого
используют бензиловый спирт (ГОСТ 8751-72, ч. д. а.).
При использовании метода внутреннего стандарта к препарату в
количестве около 2 г (точная навеска) прибавляют около 0,005 г
бензилового спирта (точная навеска), смесь перемешивают и
хроматографируют.
Содержание фенола в препарате в процентах (X) вычисляют по
формуле:
КS1Р2 х 100
Х = ------------
S2Р1
где S1 - площадь пика фенола; S2 - площадь пика бензилового
спирта; Р1 - навеска препарата в граммах; Р2 - навеска бензилового
спирта в граммах; К - калибровочный коэффициент.
Калибровочный коэффициент определяют на 3-4 калибровочных
смесях фенола и бензилового спирта.
Для метода абсолютной калибровки график строят по 4-5
калибровочным смесям с концентрацией фенола от 0,10 до 0,50%.
Примечание. 1. Определение калибровочного коэффициента (К):
фенол и бензиловый спирт, взятые в количествах около 0,125 г
(точные навески), помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл,
растворяют навески в 25-30 мл воды, доводят объем раствора водой
до метки и хроматографируют. Рассчитывают среднее значение
калибровочного коэффициента не менее чем из 3 определений по
формуле:
S2 x Рх
К = ---------,
S1 x P2
где Рх - навеска фенола в граммах.
2. Приготовление калибровочных смесей: 0,050; 0,100; 0,150;
0,200; 0,250 г фенола (точные навески) вносят соответственно в 5
мерных колб вместимостью 50 мл. Навески растворяют в 20 мл воды и
доводят объем раствора водой до метки. Срок годности растворов -
14 сут при хранении при температуре от 4 до 8 град. С.
3. Приготовление суспензий к анализу: во флакон с суспензией
вносят 1-2 капли хлористоводородной кислоты и встряхивают.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ НИПАГИНА
Метод газовой хроматографии. Используют газовый хроматограф с
пламенно - ионизационным детектором, хроматографическую колонку
50 х 0,3 см, заполненную сорбентом 5% неопентилгликольсукцината на
промытом кислотой и силанизированном носителе "Хроматон N" с
размером частиц 0,125-0,250 мм (возможно применение других
носителей типа "Хромосорб", "Инертон" тех же квалификаций).
Температура колонки, узла ввода пробы и детектора 170, 220, 240
град. С соответственно. Скорость газа - носителя (азот) 20-50
мл/мин. Пробу вводят непосредственно в хроматографическую колонку;
ее величина определяется чувствительностью детектора (2-5 мкл).
Содержание нипагина в препарате определяют методом абсолютной
калибровки или методом внутреннего стандарта, в качестве которого
используют нипазол (ТУ 6-09-4727-79).
При использовании метода внутреннего стандарта к препарату или
к подготовленной к анализу суспензии в количестве около 5 мл
(точная навеска) прибавляют 1 мл раствора внутреннего стандарта,
раствор тщательно перемешивают, отбирают пробу и хроматографируют.
Содержание нипагина в препарате в процентах (X) вычисляют по
формуле:
КS1 x Р2
Х = --------- x 100,
S2 x P1
где S1 - площадь пика нипагина; S2 - площадь пика нипазола; Р1 -
навеска препарата в граммах; Р2 - навеска нипазола в граммах; К -
калибровочный коэффициент.
Калибровочный коэффициент определяют на 3-4 искусственных
смесях нипагина и нипазола с равными концентрациями компонентов.
Для метода абсолютной калибровки график строят по 4-5
искусственным смесям с концентрацией нипагина от 0,05 до 0,15%.
Примечания. 1. Определение калибровочного коэффициента:
нипагин и нипазол, взятые в количествах по 0,050 г (точные
навески), помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, прибавляют 5
мл спирта, растворяют и доводят объем раствора водой до метки и
хроматографируют. Рассчитывают среднее значение калибровочного
коэффициента не менее чем из 3 определений по формуле:
S2 x Рх
К = ---------,
S1 x P2
где Рх - навеска нипагина в граммах.
Раствор должен быть свежеприготовленным.
2. Приготовление калибровочных смесей: 0,025; 0,040; 0,050;
0,060; 0,075 г нипагина (точные навески) вносят соответственно в 5
мерных колб вместимостью 50 мл. В каждую колбу прибавляют по 2,5
мл 95% спирта, растворяют навеску и доводят объем раствора водой
до метки.
Раствор должен быть свежеприготовленным.
3. Приготовление раствора внутреннего стандарта: около 0,125 г
нипазола (точная навеска) вносят в мерную колбу с притертой
пробкой вместимостью 25 мл, прибавляют 10 мл 95% спирта,
растворяют и доводят объем раствора 95% спиртом до метки.
Срок годности раствора 14 сут при хранении при температуре от
4 до 8 град. С.
4. Приготовление суспензий к анализу: во флакон с суспензией
вносят 1-2 капли хлористоводородной кислоты и встряхивают.
МЕТОДЫ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ
ВИТАМИНОВ В ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМАХ
1. Определение ретинола ацетата
и ретинола пальмитата (витамина А)
а) Точную навеску порошка растертых драже (не более 1 г) или 2
таблетки, покрытые оболочкой и растертые в порошок, количественно
переносят 15 миллилитрами предварительно свежепрокипяченной и
охлажденной до температуры 40 град. С воды в коническую колбу
вместимостью 100 мл, нагревают на водяной бане при температуре от
60 до 70 град. С при перемешивании в течение 5 мин, прибавляют 8
мл раствора аммиака и нагревают при той же температуре в течение
15 мин. Затем прибавляют 30 мл 95% спирта, 3 мл 50% раствора
едкого кали и нагревают в течение 30 мин на водяной бане с
обратным холодильником при температуре кипения смеси. Содержимое
колбы тотчас охлаждают до комнатной температуры, количественно
переносят 50 мл воды в делительную воронку и извлекают 150 мл
эфира для наркоза в течение 2 мин. В случае образования эмульсии
проводят дополнительное извлечение эфиром 3 раза по 25 мл.
Объединенные эфирные извлечения промывают сначала 30 мл воды,
затем 50 мл 4% раствора едкого кали и снова водой по 50 мл до
исчезновения щелочной реакции промывных вод (проба с
фенолфталеином). Промытые эфирные извлечения количественно
переносят в мерную колбу вместимостью 250 мл, доводят объем
раствора эфиром до метки и перемешивают; 5 мл полученного раствора
помещают в коническую колбу вместимостью 50 мл. Эфир отгоняют в
токе азота или под вакуумом на водяной бане при температуре не
выше 40 град. С. Остаток растворяют в пропаноле - 2 до получения
концентрации витамина А около 2 мкг (6 ME) в 1 мл.
Измеряют оптическую плотность полученного раствора на
спектрофотометре при длинах волн 300, 310, 325, 334 нм в кювете с
толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют
пропанол - 2.
Отношение значения оптической плотности при длине волны 300 нм
к значению оптической плотности при длине волны 325 нм не должно
превышать 0,73.
Вычисляют оптическую плотность D325 (испр.) с поправкой на
сопутствующие витамину А примеси по следующему уравнению:
D325 (испр.) = 6,185 х D325 - 2,555 х D310 - 4,260 х D334,
где D325, D310 и D334 - оптические плотности испытуемого раствора
при соответствующих длинах волн.
Если D325 (испр.) не отличается от D325 больше чем на +/-5 %,
то содержание витамина А в ME в одной таблетке или драже (X)
вычисляют по формуле:
D325 х 250 х V х 3330000 х б D325 х V х 915 х б
Х = ---------------------------- = --------------------
а х 5 х 100 х 1820 а
где D325 - оптическая плотность испытуемого раствора при длине
волны 325 нм; 250; 5 и V - разведения в миллилитрах; 3330000 -
количество витамина А в ME, соответствующее одному грамму 100 %
ретинола; а - навеска препарата в граммах или количество таблеток,
покрытых оболочкой; б - средняя масса одного драже в граммах; 1820
1 %
удельный показатель поглощения (Е ) 100% ретинола в пропаноле -
1 см
2 при длине волны 325 нм.
Если D325 (испр.) отличается от D325 больше чем на +/- 5%,
содержание витамина А в ME в одном драже или таблетке вычисляют по
вышеприведенной формуле, подставляя вместо D325 величину
D325 (испр.).
б) При наличии в составе испытуемого препарата
альфа - токоферола ацетата (витамина Е) дополнительно проводят
гидрирование. Для этого промытые эфирные извлечения, полученные,
как указано выше, упаривают в токе азота или под вакуумом на
водяной бане при температуре не выше 40 град. С. Остаток тотчас
растворяют в пропаноле - 2 до получения концентрации ретинола
около 20 мкг (60 ME) в 1 мл (раствор А).
15 мл раствора А переносят в колбу для гидрирования
вместимостью 50 мл, прибавляют около 0,2 г палладиевого
катализатора, перемешивают и гидрируют в течение 15 мин в приборе,
изображенном на рис. 5. <*>
--------------------------------
<*> Рис. 5. Прибор для гидрирования.
а - газометр с водородом; б - бюретка, снабженная тройным
краном; в - колба для гидрирования; г - магнитная мешалка.
(Рисунок не приводится).
При проведении гидрирования водород из газометра а забирают в
бюретку б, снабженную тройным краном и заполненную водой. Сначала
тройной кран поворачивают так, чтобы провести забор водорода из
газометра, после чего кран газометра закрывают, а тройной кран
бюретки поворачивают так, чтобы водород из бюретки поступал в
колбу для гидрирования, снабженную небольшой вводной трубкой.
Перемешивание раствора при гидрировании проводят с помощью
магнитной мешалки.
Для вытеснения воздуха из колбы через всю систему 3 раза
пропускают водород. После заполнения системы водородом колбу
закрывают пробкой, включают магнитную мешалку и ведут гидрирование
при комнатной температуре. Расход водорода на гидрирование
наблюдают по уменьшению объема водорода в бюретке.
Примечание. Проба на полноту гидрирования: 1 мл фильтрата
помещают в фарфоровую чашку и удаляют растворитель упариванием на
закрытой водяной бане. Остаток растворяют в 1 мл хлороформа,
прибавляют 5 мл раствора сурьмы хлорида; не должно появляться
синего окрашивания. В случае появления окраски гидрирование
продолжают в течение более длительного времени, прибавляя
катализатор.
По окончании гидрирования в колбу прибавляют 0,3 г силикагеля
марки КСМ или ШСМ, перемешивают и фильтруют; 3 мл фильтрата
помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводят объем раствора
пропанолом - 2 до метки и перемешивают (раствор Б).
3 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл,
доводят объем раствора пропанолом - 2 до метки и перемешивают
(раствор В).
Измеряют оптическую плотность раствора В на спектрофотометре
при длинах волн 300, 310, 325, 334 нм в кювете с толщиной слоя 10
мм.
В качестве раствора сравнения используют раствор Б.
Содержание витамина А в ME в одной таблетке или драже
вычисляют, как описано выше, введя в формулу расчета разведение в
пропаноле - 2.
Примечания. 1. При анализе таблеток, покрытых оболочкой,
средняя масса таблетки в формуле не учитывается.
2. При анализе препаратов, не содержащих аскорбиновую кислоту,
перед омылением прибавляют к испытуемой навеске 0,1 г аскорбиновой
кислоты.
3. 1 г 100% ретинола ацетата соответствует 2907000 ME. 1 г
100% ретинола пальмитата соответствует 1817000 ME.
4. Пропанол-2 (изопропиловый спирт) (х. ч.) при измерении
поглощения должен иметь величину оптической плотности, не
превышающую 0,01 в области от 320 до 350 нм и 0,05 - от 280 до 300
нм по сравнению с водой в кювете с толщиной слоя 10 мм.
5. Очистка азота: азот газообразный (ос. ч.) пропускают
последовательно через поглотители со щелочным раствором
пирогаллола А [5 г пирогаллола А (ч. д. а.) на 100 мл 20% раствора
едкого кали], концентрированной серной кислотой, стеклянной ватой
и плавленым кальция хлоридом.
6. Приготовление палладиевого катализатора: в трехгорлую колбу
вместимостью 1,5-2 л с мешалкой помещают 840 мл воды, 100 мл
концентрированного раствора аммиака и 210 г аммония карбоната
(х. ч. или ч. д. а.).
При непрерывном перемешивании реакционную массу нагревают до
температуры 50 град. С и в течение 30 мин прибавляют раствор,
полученный растворением 52,5 г кальция карбоната (ч. д. а.) в
смеси 130 мл концентрированной кислоты хлористоводородной с 130 мл
воды. Температуру реакционной массы поддерживают от 50 до 80 град.
С. Выделившийся белый осадок отфильтровывают и тщательно промывают
водой до исчезновения запаха аммиака. После этого осадок отжимают.
В колбу с суспензией свежеосажденного кальция карбоната в 400 мл
воды прибавляют при интенсивном перемешивании горячий раствор,
полученный растворением 5 г палладия хлорида (ч. д. а. или ч.) в
смеси 12 мл концентрированной хлористоводородной кислоты с 30 мл
воды. Смесь перемешивают 10 мин, затем нагревают от 80 до 85 град.
С и при этой температуре перемешивают в течение 15 мин. Горячую
смесь насыщают водородом (марки А) в течение 6 ч. Приготовленный
катализатор промывают водой до отсутствия ионов хлора. Получают
около 43 г палладированного кальция карбоната, который сушат при
температуре от 100 до 105 град. С до постоянной массы. Хранят в
банке оранжевого стекла при комнатной температуре. Годен в течение
3 мес.
2. Определение содержания витамина А
в жирах рыб и морских млекопитающих
Около 1,5 г жира (точная навеска) помещают в колбу
вместимостью 100 мл, прибавляют 0,1 г аскорбиновой кислоты, 30 мл
свежеприготовленного 10% спиртового раствора едкого кали и
нагревают на водяной бане с обратным холодильником в течение 30
мин при температуре кипения смеси. Содержимое колбы тотчас
охлаждают, прибавляют 50 мл воды, переносят в делительную воронку
вместимостью 250 мл и трижды извлекают эфиром для наркоза: первый
раз 50 мл, второй и третий раз по 30 мл. Объединенные эфирные
извлечения промывают сначала 30 мл воды, затем 50 мл 4% раствора
едкого кали и снова водой от 30 до 40 мл до исчезновения щелочной
реакции промывных вод (проба с фенолфталеином). Промытые эфирные
извлечения медленно фильтруют через бумажный фильтр с 8 г
безводного натрия сульфата в колбу для отгона. Фильтр с натрия
сульфатом 3 раза промывают эфиром по 10 мл, который фильтруют в ту
же колбу. Эфир отгоняют в токе азота на водяной бане при
температуре не выше 40 град. С. Остаток растворяют в небольшом
объеме хлороформа для наркоза и разбавляют тем же хлороформом так,
чтобы в 1 мл раствора содержалось около 30 ME витамина А; 0,4 мл
полученного раствора переносят в кювету фотоэлектроколориметра с
толщиной слоя 10 мм и быстро прибавляют 4 мл хлороформного
раствора сурьмы хлорида, содержащего 2% уксусного ангидрида.
Измеряют оптическую плотность раствора на фотоэлектроколориметре
при длине волны около 620 нм. Показание прибора отмечают не
позднее чем через 5 с после прибавления в кювету хлороформного
раствора сурьмы хлорида.
По калибровочному графику находят содержание витамина А в
международных единицах в 1 мл испытуемого раствора.
Содержание витамина А в 1 г жира в международных единицах (МЕ)
(X) вычисляют по формуле:
СV
Х = ----,
а
где С - содержание витамина А в 1 мл раствора, найденное по
калибровочному графику, в международных единицах (МЕ); V -
разведение в миллилитрах; а - навеска в граммах.
Примечания. 1. Построение калибровочного графика: около 0,1 г
(точная навеска) раствора ретинола ацетата в масле активностью
100000 ME в 1 мл для инъекций с учетом фактического содержания
витамина А разводят в хлороформе для наркоза таким образом, чтобы
получить раствор, содержащий 100 ME витамина А в 1 мл. Затем из
него готовят последовательные разведения с содержанием витамина А
от 5 до 50 ME в 1 мл с интервалом 5 ME. Из каждого разведения
отбирают по 0,4 мл раствора и проводят колориметрическую реакцию
так же, как при анализе испытуемого раствора. Для построения
калибровочного графика откладывают по оси ординат найденные
значения оптической плотности, а по оси абсцисс - соответствующие
им количества витамина А в 1 мл раствора в международных единицах.
При смене реактивов (особенно раствора сурьмы хлорида)
калибровочный график проверяют, используя для этого
свежеприготовленные хлороформные растворы препарата витамина А,
применяемого в качестве эталонного раствора.
2. Приготовление хлороформного раствора сурьмы хлорида,
содержащего 2% уксусного ангидрида: 230 г сурьмы треххлорной
помещают в колбу и растворяют в 1 л хлороформа для наркоза при
нагревании на водяной бане при температуре около 40 град. С. Колбу
закрывают притертой пробкой и оставляют на ночь. Прозрачную часть
раствора сливают в мерный цилиндр вместимостью 1 л, прибавляют 2%
(по объему) уксусного ангидрида, переносят в банку оранжевого
стекла, перемешивают и закрывают притертой пробкой. Раствор годен
для анализа через сутки после приготовления в течение 42 сут.
3. Определение содержания тиамина хлорида
и тиамина бромида (витамина B1)
Точную навеску порошка растертых драже, таблеток или
количество таблеток, покрытых оболочкой, растертых в порошок,
указанное в соответствующих частных статьях, количественно
переносят 30 миллилитрами раствора хлористоводородной кислоты
(0,01 моль/л) в мерную колбу вместимостью 100 мл, взбалтывают,
доводят объем раствора тем же растворителем до метки и фильтруют;
первые 10 мл отбрасывают. Из полученного раствора готовят с
использованием раствора хлористоводородной кислоты (0,01 моль/л)
раствор второго разведения так, чтобы содержание в нем витамина B1
(в пересчете на тиамина хлорид) было около 0,001 мг в 1 мл.
1 мл полученного раствора помещают в делительную воронку с
притертой пробкой вместимостью 50 мл, во вторую делительную
воронку помещают 1 мл раствора стандартного образца тиамина
хлорида. В обе делительные воронки прибавляют по 4 мл
подкисленного раствора калия хлорида и по 3 мл окислительной
смеси; воронки одновременно встряхивают и оставляют стоять в
течение 1 мин, затем прибавляют по 15 мл изобутилового или
изоамилового спирта, или бутанола-1, одновременно энергично
встряхивают в течение 2 мин и дают разделиться слоям. Водный слой
удаляют, спиртовой фильтруют через бумажный фильтр с 1 г
безводного натрия сульфата. Полученные фильтраты переносят в
кювету флуориметра и измеряют флюоресценцию растворов при длине
волны около 436 нм. Установку прибора проводят по раствору
рабочего стандартного образца тиамина хлорида.
Содержание витамина B1 в пересчете на тиамина хлорид
(C12H17ClN4ОS х НСl) в одном драже или одной таблетке в граммах
(X) вычисляют по формуле:
А1 х 0,001 х 100 х V3 х б А1 х V3 х б
Х = --------------------------- = ---------------------
A2 х а х V2 х 1000 А2 х а х V2 х 10000
где А1 - показание флуориметра испытуемого раствора; А2 -
показание флуориметра раствора рабочего стандартного образца
тиамина хлорида; 0,001 - содержание тиамина хлорида в 1 мл
раствора рабочего стандартного образца в миллиграммах; 100, V2, V3
- разведения в миллилитрах; а - навеска препарата в граммах или
количество таблеток, покрытых оболочкой; б - средняя масса одного
драже или одной таблетки, г; 1000 - пересчет в граммы.
Примечания. 1. Приготовление раствора рабочего стандартного
образца тиамина хлорида: 0,1000 г тиамина хлорида, предварительно
высушенного при температуре от 100 до 105 град. С в течение 2 ч,
растворяют в воде в мерной колбе вместимостью 1 л, прибавляют 10
капель концентрированной хлористоводородной кислоты и доводят
объем раствора водой до метки (основной раствор). Раствор годен в
течение 1 мес при хранении в банке оранжевого стекла с притертой
пробкой при температуре от 5 до 10 град. С.
1 мл основного раствора помещают в мерную колбу вместимостью
100 мл и доводят объем раствора водой до метки.
1 мл раствора рабочего стандартного образца содержит 0,001 мг
тиамина хлорида.
Раствор годен в день приготовления.
2. Окислительная смесь: 0,01 г калия феррицианида растворяют в
1 мл воды и доводят объем раствора 15% раствором едкого натра до
25 мл. Раствор готовят непосредственно перед употреблением.
3. Изобутиловый спирт (ч. д. а.) или изоамиловый спирт (ч. д.
а.), или бутанол-1 (ч. д. а.) проверяют на отсутствие
флюоресценции. В случае наличия флюоресценции спирт перед
употреблением подвергают очистке следующим образом: к 1 л спирта
прибавляют от 15 до 20 г активированного угля, энергично
встряхивают в течение 30 мин, оставляют на сутки и отгоняют.
4. Приготовление подкисленного раствора калия хлорида: 125 г
калия хлорида растворяют в 400 мл воды в мерной колбе вместимостью
500 мл, прибавляют 4,5 мл концентрированной хлористоводородной
кислоты и доводят объем раствора водой до метки.
5. Коэффициент пересчета тиамина хлорида на тиамина
бромид-1,29.
4. Определение содержания рибофлавина (витамина В2)
Точную навеску порошка растертых драже, таблеток или
количество таблеток, покрытых оболочкой, растертых в порошок,
указанных в соответствующих частных статьях, взбалтывают в горячей
воде при подогревании на водяной бане, количественно переносят в
мерную колбу вместимостью 500 мл, охлаждают, доводят объем
раствора водой до метки и фильтруют; первые 10 мл отбрасывают. Из
полученного раствора готовят раствор второго разведения с таким
расчетом, чтобы содержание в нем рибофлавина было около 0,0004 мг
в 1 мл. В кюветы флуориметра помещают: в одну - 10 мл испытуемого
раствора, в другую - 10 мл раствора рабочего стандартного образца
рибофлавина и измеряют флюоресценцию при длине волны около 440 нм.
Параллельно в другие кюветы помещают: в одну - 10 мл испытуемого
раствора и в другую - 10 мл раствора рабочего стандартного образца
рибофлавина, в каждую прибавляют по 0,1 г натрия гидрокарбоната и
натрия гидросульфита, перемешивают и измеряют флюоресценцию
растворов.
Установку проводят по раствору рабочего стандартного образца
рибофлавина.
Содержание C17H2ОN4О6 (рибофлавина) в одном драже или одной
таблетке в граммах (X) вычисляют по формуле:
(А - А1) х 0,0004 х 500 х V3 х б
Х = -------------------------------- =
(В - В1) х а х V2 х 1000
(А - A1) х V3 х б
= --------------------------
(В - В1) х а х V2 х 5000
где А - показание флуориметра испытуемого раствора; А1 - то же
после гашения флюоресценции; В - показание флуориметра раствора
рабочего стандартного образца рибофлавина; В1 - то же после
гашения флюоресценции; 500; V2 и V3 - разведения в миллилитрах;
0,0004 - содержание рибофлавина в 1 мл раствора рабочего
стандартного образца в миллиграммах; а - навеска препарата в
граммах или количество таблеток, покрытых оболочкой; б - средняя
масса одного драже или одной таблетки в граммах; 1000 - пересчет в
граммы.
Примечание. Приготовление раствора рабочего стандартного
образца рибофлавина: 0,0400 г рибофлавина, предварительно
высушенного при температуре от 100 до 105 град. С в течение 2 ч,
растворяют в горячей воде в мерной колбе вместимостью 1 л при
подогревании на водяной бане, после охлаждения доводят объем
раствора водой до метки (основной раствор). Раствор годен в
течение 1 мес при хранении в банке оранжевого стекла с притертой
пробкой при температуре от 5 до 10 град. С.
1 мл основного раствора помещают в мерную колбу вместимостью
100 мл и доводят объем раствора водой до метки; 1 мл раствора
рабочего стандартного образца содержит 0,0001 мг рибофлавина.
Раствор годен в день приготовления.
5. Определение содержания
пиридоксина гидрохлорида (витамина B6)
Точную навеску порошка растертых драже, таблеток или
количество таблеток, покрытых оболочкой, растертых в порошок,
указанных в соответствующих частных статьях, количественно
переносят водой в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем
раствора водой до метки, перемешивают и фильтруют; первые 10 мл
отбрасывают. Из полученного раствора готовят раствор второго
разведения с таким расчетом, чтобы содержание в нем пиридоксина
гидрохлорида было около 0,01 мг в 1 мл; 5 мл полученного раствора
переносят в делительную воронку вместимостью 50 мл, прибавляют 10
мл фосфатного буферного раствора (0,2 моль/л), 1 мл 0,1% раствора
диэтил-п-фенилендиамина сульфата, перемешивают, прибавляют 10 мл
этилацетата, 2 мл 1% раствора калия феррицианида и немедленно
тщательно перемешивают. Дают слоям разделиться, нижний водный слой
сливают в колбу и оставляют для повторного извлечения, верхний
этилацетатный слой фильтруют через сухой бумажный фильтр, на
который помещено около 8 г безводного натрия сульфата, в мерную
колбу вместимостью 25 мл. Нижний водный слой повторно извлекают 10
мл этилацетата, фильтруют, фильтр промывают этилацетатом,
присоединяют его к первому извлечению в мерной колбе и доводят
объем раствора этилацетатом до метки. Измеряют оптическую
плотность полученного раствора синего цвета на спектрофотометре
или фотоэлектроколориметре при длине волны 600 нм в кюветах с
толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют
этилацетат.
Параллельно проводят опыт с раствором рабочего стандартного
образца пиридоксина гидрохлорида. Для этого 5 мл раствора рабочего
стандартного образца пиридоксина гидрохлорида помещают в
делительную воронку и далее поступают так, как описано выше.
Содержание С8Н11NО3 х НСl (пиридоксина гидрохлорида) в одном
драже или одной таблетке в граммах (X) вычисляют по формуле:
D1 х 0,01 х 100 х V3 х б D1 х V3 х б
Х = -------------------------- = --------------------,
D0 х а х V2 х 1000 D0 х а х V2 х 1000
где D1 - оптическая плотность испытуемого раствора; D0 -
оптическая плотность раствора рабочего стандартного образца
пиридоксина гидрохлорида; 0,01 - содержание пиридоксина
гидрохлорида в 1 мл раствора рабочего стандартного образца в
миллиграммах; 100, V2 и V3 - разведения в миллилитрах; а - навеска
препарата в граммах или количество таблеток, покрытых оболочкой; б
- средняя масса одного драже или одной таблетки в граммах; 1000 -
пересчет в граммы.
Примечания. 1. Приготовление раствора рабочего стандартного
образца пиридоксина гидрохлорида: 0,0500 г пиридоксина
гидрохлорида растворяют в воде в мерной колбе вместимостью 250 мл
и доводят объем раствора водой до метки (основной раствор).
Раствор годен в течение месяца при хранении в склянке оранжевого
стекла с притертой пробкой при температуре от 5 до 10 град. С.
5 мл основного раствора помещают в мерную колбу вместимостью
100 мл и доводят объем раствора водой до метки.
1 мл раствора рабочего стандартного образца содержит 0,01 мг
пиридоксина гидрохлорида.
Раствор годен в день приготовления.
2. Приготовление фосфатного буферного раствора (0,2 моль/л) рН
6,9 - 7,1:
1) 71,64 г натрия фосфата двузамещенного (Na2HPO х 12Н2О)
растворяют в воде в мерной колбе вместимостью 1 л и доводят объем
раствора водой до метки;
2) 27,22 г калия фосфата однозамещенного (КН2РО4) растворяют в
воде в мерной колбе вместимостью 1 л и доводят объем раствора
водой до метки;
3) 150 мл раствора натрия фосфата двузамещенного смешивают со
100 мл раствора калия фосфата однозамещенного.
рН полученного раствора 6,9-7,1 (потенциометрически).
Раствор годен в течение 5 сут при хранении при температуре от
5 до 10 град. С.
3. Приготовление раствора сульфата диэтил - п -
фенилендиамина: 0,1 г сульфата диэтил - п - фенилендиамина (ч. д.
а. или ч.) растворяют в воде в мерной колбе вместимостью 100 мл,
доводят объем раствора водой до метки и перемешивают.
Раствор готовят непосредственно перед употреблением.
6. Определение цианокобаламина (витамина В12)
Содержание цианокобаламина определяют микробиологическим
методом с Escherichia coli 113-3 в качестве тест - микроорганизма.
Точную навеску порошка растертых драже, таблеток или
количество таблеток, покрытых оболочкой, растертых в порошок,
указанное в соответствующих частных статьях, количественно
переносят водой в мерную колбу определенной вместимости и доводят
объем раствора водой до метки, перемешивают и фильтруют. Из
полученного раствора делают разведение 1% раствором натрия цитрата
с таким расчетом, чтобы концентрация раствора для анализа была
близкой к контрольной концентрации раствора Государственного
стандартного образца - 0,05 мкг в 1 мл.
В чашки Петри (6 чашек для построения стандартной кривой и 3
чашки для раствора испытуемого препарата) одинакового диаметра с
ровным и плоским дном, установленные на горизонтальном столе,
отрегулированном по ватерпасу, разливают по 10-12 мл расплавленной
и охлажденной до температуры 48-50 град. С основной среды,
засеянной суспензией Е. coli 113-3 из расчета от 4 до 6 мл
суспензии на 200 мл основной среды. После застывания среды на
каждой чашке стерильным бором делают по трафарету под углом 60
град. С друг к другу 6 лунок диаметром 8 мм.
В три лунки (через одну) 6 чашек, используемых для построения
стандартной кривой, и 3 чашек - для раствора испытуемого
препарата, вносят по 0,1 мл раствора Государственного стандартного
образца контрольной концентрации (0,05 мкг/мл). В три лунки (через
одну) каждых 3 чашек вносят по 0,1 мл одной из концентрации
остальных растворов Государственного стандартного образца, а также
раствора испытуемого препарата. Чашки выдерживают в термостате при
37 град. С от 16 до 18 ч. После этого измеряют диаметры зон
стимуляции роста тест - микроорганизма для каждой концентраций
растворов Государственного стандартного образца.
После измерения зон роста для всех концентраций рассчитывают
среднюю величину зоны, учитывая в каждом случае 3 чашки, т. е. 9
зон, затем рассчитывают среднюю величину зоны для контрольной
концентрации, учитывая все чашки, т. е. 27 зон.
По разности между средней величиной зоны контрольной
концентрации раствора (0,05 мкг/мл), выведенной из всех чашек, и
средней величиной зоны контрольной концентрации раствора
Государственного стандартного образца, выведенной из 3 чашек с
каждой отдельной концентрацией, находят поправку к величине зоны
данной концентрации. Найденную поправку прибавляют к средней
величине зоны данной концентрации, если она положительная, и
вычитают, если она отрицательная. Аналогичным образом делают
поправку к концентрации раствора испытуемого препарата.
Содержание С63Н88СоN14О14Р (цианокобаламина) в одном драже или
одной таблетке в граммах (X) вычисляют по формуле:
С х б х К
Х = -------------,
а х 1 000 000
где С - содержание цианокобаламина в 1 мл испытуемого раствора,
найденное по стандартной кривой, в микрограммах; К - коэффициент
разведения; а - навеска препарата в граммах или количество
таблеток, покрытых оболочкой; б - средняя масса одного драже в
граммах; 1 000 000 - пересчет в граммы.
Примечания. 1. Приготовление раствора Государственного
стандартного образца цианокобаламина: 0,0250 г Государственного
стандартного образца цианокобаламина в пересчете на 100% вещество
растворяют в 25% спирте в мерной колбе вместимостью 250 мл и
доводят объем раствора тем же спиртом до метки.
1 мл полученного раствора содержит 100 мкг цианокобаламина
(основной раствор).
Раствор годен в течение 2 мес при хранении при температуре 4-6
град. С в банке оранжевого стекла с притертой пробкой. 1 мл
основного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл и
доводят объем раствора водой до метки (рабочий раствор). Раствор
годен в течение 5 сут при хранении при температуре от 12 до 15
град. С.
1 мл рабочего раствора содержит 1 мкг цианокобаламина. Из
рабочего раствора Государственного стандартного образца в день
определения готовят растворы, содержащие 0,025; 0,05 и 0,075 мкг
цианокобаламина в 1 мл. Для этого соответственно 2,5; 5 и 7,5 мл
рабочего раствора Государственного стандартного образца помещают в
мерные колбы вместимостью 100 мл, доводят объемы растворов в
колбах 1% раствором натрия цитрата до метки и перемешивают.
Раствор, содержащий 0,05 мкг цианокобаламина в 1 мл, принимают
за раствор Государственного стандартного образца контрольной
концентрации.
2. Построение стандартной кривой: по исправленным значениям
величин зон приготовленных концентраций и средней величине зоны
контрольной концентрации из всех чашек строят стандартную кривую,
откладывая на оси абсцисс концентрации цианокобаламина в мкг/мл, а
на оси ординат - соответствующие им величины диаметров зон роста.
По полученным точкам вычерчивают кривую.
Применяемые для построения кривой концентрации не должны
отличаться от контрольной концентрации более чем на -40 или +50%.
3. Хранение и подготовка тест - культуры для анализа: музейную
культуру выращивают на скошенной агаровой среде и хранят в
холодильнике. Один раз в месяц культуру пересеивают на свежую
среду и после переноса выдерживают от 16 до 18 ч при 37 град. С.
Состав среды для хранения культуры:
казеинового кислотного гидролизата 10% 6 мл
калия фосфата двузамещенного (х. ч.) 0,02 г
железа сульфата (х. ч.) 0,0005 г
магния сульфата (х. ч.) 0,02 г
L-аспарагина (ч.) 0,02 г
глицерина (ч.) 0,2 г
агара микробиологического 1,5 г
цианокобаламина 10 мкг
воды до 100 мл
рН среды до стерилизации 7,0 (потенциометрически).
Ингредиенты растворяют последовательно в воде.
Аспарагин растворяют отдельно в 10 мл воды с прибавлением 2
капель раствора хлористоводородной кислоты (1 моль/л) при слабом
подогревании и прибавляют к раствору солей; устанавливают рН
полученной смеси до 7,0 15% раствором едкого натра, доводят объем
среды водой до 100 мл, прибавляют 0,2 г глицерина и 1,5 г агара
микробиологического. Смесь подогревают на водяной бане до полного
растворения агара, затем прибавляют 10 мкг цианокобаламина. За
сутки до проведения анализа тест - культуру пересевают на
скошенный пептонно - солевой агар следующего состава:
пептона ферментативного сухого 2 г
натрия хлорида (х. ч.) 0,5 г
агара микробиологического 1,8 г
воды до 100 мл
рН среды до стерилизации 7,0 (потенциометрически).
Обе среды разливают в пробирки по 5 мл, стерилизуют насыщенным
паром под давлением в паровом стерилизаторе при 1 ати (0,1 МПа) 20
мин. Пробирки охлаждают в наклонном положении. На скошенный агар
делают посев музейной культуры. Тест - культуру инкубируют от 16
до 18 ч при 37 град. С и используют для приготовления посевного
материала.
4. Приготовление 10% казеинового кислотного гидролизата: 100 г
казеина размолотого смешивают в колбе вместимостью 1 л с 500 мл 20
% раствора хлористоводородной кислоты. Смесь нагревают с обратным
холодильником в течение 24 ч. Первые 5-8 ч до растворения казеина
нагревание проводят на кипящей водяной бане, а затем на
электроплитке с асбестовой сеткой. Из полученного гидролизата при
пониженном давлении отгоняют хлористоводородную кислоту. К густому
остатку прибавляют 300 мл воды, перемешивают и снова отгоняют до
получения густого сиропа. Указанную операцию повторяют дважды,
растворяют оставшуюся массу приблизительно в 100 мл воды,
устанавливают рН 3,5 при помощи раствора едкого натра (5 моль/л) и
объем раствора доводят водой до 1 л. К раствору прибавляют 20 г
угля активированного осветляющего, встряхивают в течение 1 ч,
затем фильтруют на воронке Бюхнера с отсасыванием. Обработку углем
повторяют еще раз и получают бесцветный или светло - желтый
раствор, который разливают в колбы по 100 мл и стерилизуют
насыщенным паром под давлением в паровом стерилизаторе при 1 ати
(0,1 МПа) 20 мин.
5. Приготовление 20% раствора хлористоводородной кислоты: 425
мл концентрированной хлористоводородной кислоты (d 1,19)
разбавляют водой до 1 л.
6. Приготовление посевного материала: делают смыв суточной
тест - культуры со скошенного пептонно - солевого агара раствором
натрия хлорида изотоническим 0,9%. Плотность микробной взвеси
должна быть от 1 до 2 млрд микробных клеток в 1 мл.
7. Приготовление основной питательной среды.
Состав среды:
аммония хлорида (х. ч.) 2 г
натрия хлорида (х. ч.) 3 г
калия фосфата двузамещенного (х. ч.) 0,4 г
натрия цитрата трехзамещенного (х. ч.) 3 г
сахара молочного 3 г
агара микробиологического 15 г
воды дистиллированной до 1 л
рН среды до стерилизации 7,0 (потенциометрически).
Среду разливают по 200 мл в колбы и стерилизуют насыщенным
водяным паром в автоклаве при 1 ати (0,1 МПа) 20 мин. Хранят в
прохладном месте не более 2 мес. Перед розливом в чашки Петри в
расплавленную среду прибавляют по 5 мл стерильного 40% раствора
глюкозы на каждые 200 мл среды.
Раствор глюкозы стерилизуют при 0,5 ати (0,05 МПа) в течение
15 мин.
7. Приготовление 1% раствора натрия цитрата: 10 г натрия
цитрата растворяют в воде в мерной колбе вместимостью 1 л и
доводят объем раствора водой до метки.
Раствор годен в течение 7 сут при хранении при температуре от
5 до 10 град. С.
7. Определение содержания
кислоты никотиновой (витамина РР)
Точную навеску порошка растертых драже, таблеток или
количество таблеток, покрытых оболочкой, растертых в порошок,
указанных в соответствующих частных статьях, взбалтывают в горячей
воде в мерной колбе вместимостью 100 мл, охлаждают и доводят объем
раствора водой до метки, перемешивают и фильтруют; первые 10 мл
отбрасывают. Из полученного фильтрата готовят раствор второго
разведения с таким расчетом, чтобы содержание кислоты никотиновой
в нем составляло около 0,005 мг в 1 мл.
В две конические колбы с притертой пробкой вместимостью 50 мл
помещают по 5 мл испытуемого раствора, в третью колбу - 5 мл
раствора рабочего стандартного образца кислоты никотиновой, в
четвертую - 5 мл воды (контрольный опыт на реактивы).
Колбы помещают на 5 мин на водяную баню при температуре 50
град. С. Затем из бюретки (под тягой) во все колбы прибавляют по 2
мл роданобромидного раствора, перемешивают и оставляют на 10 мин
на водяной бане при той же температуре. Затем колбы быстро
охлаждают до комнатной температуры и выдерживают в защищенном от
света месте в течение 1 ч. Одновременно проводят контрольный опыт
на посторонние окрашенные вещества, присутствующие в растворе. Для
этого к 5 мл испытуемого раствора прибавляют 3 мл раствора метола
и 2 мл воды.
Измеряют оптическую плотность растворов желтого цвета на
фотоэлектроколориметре при длине волны около 440 нм в кюветах с
толщиной слоя 10 мм.
В качестве раствора сравнения используют воду.
Содержание C6H5NO2 (кислоты никотиновой) в одном драже или
одной таблетке в граммах (X) вычисляют по формуле:
(D - D1) х 0,005 х 100 х V3 х б
|
