|
Стр. 14
¦ ¦температуре¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦Candida utilis ¦Среда N 3,¦Круглые, кремового¦МПБ, ¦Рост в виде рав-¦Овальные, иногда с от-¦
¦ЛИА-01 ¦Т град.¦цвета с матовой¦рН 7,2-7,4¦номерной мути и¦ростками клетки; рас-¦
¦ ¦(30 +/-1)¦поверхностью коло-¦с 1% ¦осадка на дне ¦положены отдельно, це-¦
¦ ¦град. С,¦нии с ровными¦глюкозой, ¦ ¦почками или группами ¦
¦ ¦48 ч, ¦краями ¦18-20 ч ¦ ¦ ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦Bacillus subti -¦Среда N 1,¦Колонии желтовато-¦МПБ, ¦Рост в виде плен-¦Палочки с закругленны-¦
¦lis, var. Л2 ¦Т град.¦го цвета, круглой¦рН 7,2-7,4¦ки с осадком на¦ми краями, располагаю-¦
¦ ¦(36 +/-1)¦формы, влажно бле-¦18-20 ч ¦дне ¦щиеся отдельно и це-¦
¦ ¦град. С,¦стящие с шагрене-¦ ¦ ¦почками с хорошо выра-¦
¦ ¦18 - 20 ч,¦вой поверхностью,¦ ¦ ¦женной грамположитель-¦
¦ ¦ ¦слегка зазубренны-¦ ¦ ¦ной окраской ¦
¦ ¦ ¦ми краями и при-¦ ¦ ¦ ¦
¦ ¦ ¦поднятым центром ¦ ¦ ¦ ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦Bacillus subti -¦Среда N 1,¦Мелкие сероватые¦МПБ, ¦Рост в виде плен-¦Тонкие палочки, распо-¦
¦lis ATCC 6633 ¦Т град.¦колонии с зубчатым¦рН 6,8-7,0¦ки с осадком на¦лагающиеся отдельно ¦
¦ ¦(36 +/-1)¦краем ¦18-20 ч ¦дне ¦или цепочками, с хоро-¦
¦ ¦град. С,¦ ¦ ¦ ¦шо выраженной грампо- ¦
¦ ¦18 - 20 ч ¦ ¦ ¦ ¦ложительной окраской ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦Bacillus cereus,¦Среда N 2,¦Шероховатые коло-¦МПБ, рН ¦Морщинистая плен-¦Палочки с закругленны-¦
¦var. mycoides ¦Т град.¦нии с краем, сфор-¦ 7,8-8,0, ¦ка; вся среда¦ми концами, распола-¦
¦537 ¦(36 +/-1)¦мированным из пе-¦18-20 ч ¦прозрачная без¦гающиеся отдельно или ¦
¦ ¦град. С,¦реплетающихся во- ¦ ¦осадков ¦цепочками, с хорошо ¦
¦ ¦18 - 20 ч ¦локон ¦ ¦ ¦выраженной грамположи-¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦тельной окраской ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦Bacillus cereus,¦Среда N 1,¦Гладкие колонии с¦МПБ, рН ¦Равномерное пому-¦Тонкие с закругленными¦
¦var. mycoides ¦Т град.¦ровными краями и¦6,8-7,0, ¦тнение бульона¦концами палочки, рас-¦
¦HB ¦(36 +/-1)¦сферической по-¦18-20 ч ¦без образования ¦полагающиеся отдельно¦
¦ ¦град. С,¦верхностью ¦ ¦пленки и осадка ¦или короткими цепочка-¦
¦ ¦18 - 20 ч ¦ ¦ ¦ ¦ми, с хорошо выражен-¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ной грамположительной¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦окраской ¦
¦Bacillus pumi- ¦Среда N 1,¦Мелкие серовато -¦МПБ, рН ¦Равномерное пому-¦Тонкие, мелкие палочки¦
¦lus NCTC 8241 ¦Т град.¦голубого цвета ко-¦ 7,2-7,4, ¦тнение бульона¦с закругленными конца-¦
¦ ¦(36 +/-1)¦лонии с зазубрен-¦18-20 ч ¦без образования ¦ми, располагающиеся¦
¦ ¦град. С,¦ными краями и при-¦ ¦пленки и осадка ¦отдельно или короткими¦
¦ ¦18 - 20 ч ¦поднятым центром ¦ ¦ ¦цепочками, с хорошо¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦выраженной грамотрица-¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦тельной окраской ¦
¦Bordetella ¦МПА, ¦Мелкие, мутные,¦МПБ, ¦Заметное помутне-¦Одиночные, короткие,¦
¦bronchiseptica ¦рН 7,2-7,4¦белые, слегка вы-¦рН 7,2-7,4¦ние, серая плен-¦тонкие палочки с хоро-¦
¦ATCC 4617 ¦Т град.¦пуклые, фарфоро-¦ ¦ка, тягучий оса- ¦шо выраженной грам-¦
¦ ¦(36 +/-1)¦видные колонии ¦ ¦док ¦отрицательной окраской¦
¦ ¦град. С,¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ ¦18 - 20 ч,¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦Pseudomonas ¦МПБ, ¦Широкие, расплыв-¦МПБ, ¦Заметное помутне-¦Одиночные палочки либо¦
¦aeruginosa ¦рН 7,2-7,4¦чатые, прозрачные¦рН 7,2-7,4¦ние, толстая¦короткие цепочки с хо-¦
¦NCTC 2134 ¦Т град.¦с неровным краем¦ ¦пленка, среда мо-¦рошо выраженной грам-¦
¦ ¦(36 +/-1)¦колонии ¦ ¦жет приобретать¦отрицательной окраской¦
¦ ¦град. С,¦ ¦ ¦желтовато - зеле-¦ ¦
¦ ¦18 - 20 ч,¦ ¦ ¦ную окраску ¦ ¦
L----------------+-----------+------------------+----------+-----------------+-----------------------
Шесть стерильных цилиндров единого размера и массы, высотой
(10,0 +/-0,1) мм и внутренним диаметром (6,0 +/-0,1) мм, из
нержавеющей стали или алюминия расставляют на поверхности
засеянной среды на равном расстоянии друг от друга и от края
чашки. Вместо цилиндров могут быть использованы лунки диаметром от
6 до 8 мм, сделанные в толще агара с помощью стерильного сверла
либо другого соответствующего приспособления.
В цилиндры или лунки каждой чашки вносят равные объемы рабочих
растворов стандартного и испытуемого образцов. Основные растворы
стандартных и испытуемых образцов готовят в стерильных
растворителях с концентрацией 1 мг/мл. Затем из основных растворов
в зависимости от применяемого варианта метода диффузии в агар
(трехдозного или с построением стандартной кривой) готовят рабочие
растворы трех или одной концентраций испытуемого образца и
растворы трех или пяти концентраций стандартного образца.
Рабочие растворы испытуемых образцов готовят из основных
растворов таким образом, чтобы их концентрации не имели
существенных отличий от концентраций раствора стандартного
образца.
Для уменьшения влияния колебаний во времени между закапыванием
растворов, используемых в опыте, рекомендуется после их внесения
выдерживать чашки при комнатной температуре в течение 1-2 ч. Затем
чашки инкубируют при температуре (36 +/-1) град. С в течение 16-18
ч.
Диаметры зон угнетения роста тест - микроба при помощи
соответствующих приборов измеряют с точностью до 0,1 мм.
Определение антимикробной активности антибиотиков с
использованием трехдозного варианта метода диффузии в агар. Для
проведения испытания готовят три раствора стандартного образца
(C1, С2, С3) и три раствора испытуемого образца (И1, И2, И3).
Концентрации растворов, содержащих малую, среднюю и большую дозы,
должны находиться между собой в кратном соотношении (1:2:4). При
необходимости это соотношение может быть изменено. Концентрация
раствора С2 должна быть близка контрольной концентрации раствора
стандартного образца, указанной в табл. 17.
Все растворы стандартного и испытуемого образцов вносят в
цилиндры или лунки одной чашки Петри таким образом, чтобы растворы
с большими концентрациями не соприкасались между собой.
Предлагаемый вариант закапывания С1И3С2И1С3И2.
Число чашек, используемых в каждом опыте, должно быть
достаточным для обеспечения статистической достоверности
результатов, но не менее 6 чашек.
Последовательность внесения растворов стандартного и
испытуемого образцов в цилиндры или лунки каждой чашки должна быть
следующей: первым вносят раствор с малой концентрацией
стандартного образца (C1) и соответствующий раствор испытуемого
образца (И1). Затем растворы со средней концентрацией (С2 и И2),
последними вносят растворы с большими концентрациями (С3 и И3).
Расчет активности и дисперсионный анализ при использовании
трехдозного варианта метода диффузии в агар осуществляется в
соответствии со статьей "Статистическая обработка результатов
химического эксперимента и биологических испытаний" (ГФ XI, вып.
1, с. 199). В разделе II.5 данной статьи растворы определенных
концентраций стандартного (С) и испытуемого (И) образцов
S U
обозначены D и D соответственно.
Определение антимикробной активности антибиотиков с
использованием стандартной кривой. Постановка опыта. В день
постановки анализа из основного раствора готовят пять рабочих
растворов стандартного образца C1, С2, С3, С4, C5 с
концентрациями, увеличивающимися в геометрической прогрессии (Z),
обычно в соотношении 1:1,25. Средняя концентрация (С3) является
контрольной и должна быть близка к концентрации, указанной
в табл. 17: концентрация C1 - наименьшая, C5 - наибольшая. Для
исследования растворов каждой концентрации (кроме контрольной)
используют по три чашки. Раствор контрольной концентрации С3
закапывают в три цилиндра (или лунки) каждой из взятых в опыт
чашек, в три другие цилиндра (лунки) закапывают раствор одной из
концентраций стандартного образца, чередуя его с раствором
контрольной концентрации. Таким образом, для построения
стандартной кривой используют 12 чашек.
После инкубации в термостате измеряют диаметры зон угнетения
роста тест - микробов. Далее вычисляют среднюю величину диаметров
зон для раствора контрольной концентрации стандартного образца в
каждой группе из трех чашек, затем среднюю величину диаметров зон
для раствора контрольной концентрации стандартного образца из всех
12 чашек (общую среднюю из 36 зон). По разности между средней
величиной зоны контрольной концентрации, установленной из 12
чашек, и средней величиной зоны контрольной концентрации,
установленной из 3 чашек с каждой отдельной концентрацией, находят
поправку к величине зоны данной концентрации. Найденную поправку
прибавляют к средней величине диаметра зоны данной концентрации,
если она положительная, и вычитают, если она отрицательная.
Пример. Общая средняя величина зоны для раствора контрольной
концентрации стандартного образца 1 мкг/мл, рассчитанная из 36
зон, равна 19,2 мм. Средняя величина зоны для раствора той же
концентрации, установленная из 3 чашек, на которых испытывался
раствор с концентрацией 0,83 мкг/мл стандартного образца, равна 19
мм. Следовательно, величина поправки будет +0,2 мм. Средняя
величина зоны для концентрации 0,83 мкг/мл равна 17,9 мм;
прибавляя поправку +0,2 мм, получаем величину 18,1 мм. Таким
образом исправляют значение величины зон для растворов всех
концентраций стандартного образца и получают величины d1, d2, d4,
d5.
Для исследования активности испытуемого образца проводят
несколько определений, используя для каждого по 3 чашки, в которые
закапывают раствор контрольной концентрации стандартного образца и
раствор испытуемого образца с концентрацией, близкой к
контрольной. Внесение растворов контрольной концентрации
стандартного и испытуемого образцов в каждой группе из трех чашек
должно проводиться одномоментно. После инкубации измеряют зоны
угнетения роста тест - микроба, образуемые растворами контрольной
концентрации стандартного и испытуемого образцов. Находят среднее
значение величин зон из 3 чашек.
Расчет антимикробной активности испытуемых образцов по
стандартной кривой может быть проведен двумя способами:
графическим методом или путем непосредственного расчета с
использованием соответствующих формул.
Расчет активности испытуемого образца графическим методом. По
исправленным значениям диаметров зон d1, d2, d4, d5 для всех
концентраций растворов стандартного образца C1, C2, С4, C5 и общей
средней величине диаметров зон для контрольной концентрации d3
вычисляют с использованием метода наименьших квадратов размеры зон
Dmin и Dmax для низкой и высокой концентраций растворов
стандартного образца:
Dmin = (3d1 + 2d2 + d3 - d5) / 5;
Dmax = (3d5 + 2d4 + d3 - dl) / 5,
по которым затем строят стандартную кривую на полулогарифмической
сетке расчета биологической активности антибиотиков, откладывая на
оси абсцисс величины зон, на оси ординат - соответствующие им
концентрации растворов стандартного образца. Разность между
найденными средними величинами зон угнетения роста тест - микроба
раствором испытуемого образца и раствором контрольной концентрации
стандартного образца из тех же чашек прибавляют к значению
величины зоны, соответствующей контрольной концентрации на кривой
(D3). Затем по кривой находят концентрацию, соответствующую
найденной величине зоны. Умножением полученной концентрации на
степень разведения получают активность в 1 мл основного раствора
или в 1 мг испытуемого образца.
Пример. Средний размер зон для раствора испытуемого образца
при разведении 1:300 составляет 18,7 мм, средний размер зон для
раствора стандартного образца, содержащего 2 мкг/мл (контрольная
концентрация) из тех же чашек - 18,5 мм. Следовательно, разность
составляет + 0,2 мм. Эту разность прибавляют к величине зоны для
раствора в концентрации 2 мкг/мл по стандартной кривой, которая
равна D3 = 18,6 мм, и получают величину 18,8 мм. Находят на кривой
концентрацию, соответствующую данному размеру зоны - 2,36 мкг/мл.
Эту величину умножают на степень разведения и получают содержание
активного вещества в 1 мл основного раствора, т. е.
2,36 мкг/мл х 300 = 708 мкг/мл.
Так как концентрация основного раствора составляла 1 мг/мл, то
активность испытуемого образца равна 708 мкг/мл: 1 мг/мл = 708
мкг/мл.
Определение активности испытуемого образца расчетным путем.
Кривая, отражающая зависимость между активностью антибиотика и
размером зоны угнетения роста тест - микроба, после перехода к
координатам логарифм концентрации (lg C) - диаметр зоны (D)
преобразуется в прямую, уравнение которой:
D = a + b x lg C,
где а - свободный член; b - угловой коэффициент.
По исправленным значениям величин диаметров зон d1, d2, d4, d5
для растворов стандартного образца с концентрациями C1, С2, С4, С5
и общей средней величине диаметра зоны d3, соответствующей
контрольной С3, рассчитывают величины а и b с применением метода
наименьших квадратов. Так как концентрации C1, С2, С3, С4, C5
составляют геометрическую прогрессию, формулы для вычисления
коэффициентов а и Ь могут быть записаны в виде:
b = (-2 x d1 - d2 + d4 + 2 x d5) / 10 x lg Z;
a - d - Ь x lg C3,
где Z - знаменатель прогрессии разведения;
_
d = (d1 + d2 + d3 + d4 + d5) / 5.
Пример. Пусть знаменатель прогрессии разведения Z = 1,25, С3 =
5,0, а средние значения диаметров зон (в мм) равны: d1 = 17,64;
d2 = 18,15; d3 = 19,03; d4 = 19,58; d5 = 20,09. Тогда:
b = (-2 х 17,64 - 18,15 + 19,58 + 2 х 20,09) / (10 х lg 1,25) =
= 6,33 / 0,969 = 6,532.
_
d = (17,64 + 18,15 + 19,03 + 19,58 + 20,09) / 5 = 18,90;
а = 18,90 - 6,532 х 0,6990 = 14,33.
Если в опыте с одной стандартной кривой проведено n испытаний
образца, то логарифм среднего значения концентрации испытуемого
образца в опыте рассчитывают по формуле:
_ _
lg = C = lg C3 + (d - d ) / b,
U U S
где С - среднее значение рабочей концентрации испытуемого
U _
образца, полученное по n испытаниям; d - среднее значение
U
диаметра зон задержки роста, полученное по n параллельным
испытаниям (3n чашкам); d - среднее значение соответствующего
S
диаметра для контрольной концентрации, полученное в тех же
испытаниях (по 3n чашки).
Величину концентрации С вычисляют как антилогарифм:
U
C = antilg (lg C ).
U U
Для получения активности испытуемого образца величину С
U
умножают на его разведение в опыте - гамма .
U
Пример 1. Пусть n = 1; С3 = 5,0; d = 18,61 и d = 18,44 при
_ S _ U
гамма = 160. Тогда: d = d = 18,44; d = d = 18,61 и lg С =
U U U S S U
0,6990 + (18,44 - 18,61) / 6,532 = 0,6730; С = antilg (0,6730) =
4,710; А = 4,710 х 160 = 754. U
U
Пример 2. Пусть n = 3; С3 = 5,0; d = 18,61; d = 18,3;
S1 S2
d = 18,12; d = 18,44; d = 18,1; d = 18,3 при гамма = 160.
S3 U1 U2 U3 U
Тогда:
_
d = (18,61 + 18,3 + 18,12) / 3 = 18,34;
S
_
d = (18,44 + 18,1 + 18,3) / 3 = 18,28;
U
lg С = 0,6990 + (18,28 - 18,34) / 6,532 = 0,6990 - 0,0092 = 0,6898;
U
C = antilg (0,6898) = 4,896;
U
А = 4,896 х 160 = 783.
U
Поскольку микробиологическое исследование активности
антибиотиков подвержено вариабельности, следует проводить не менее
6 повторных испытаний в разные дни (не менее 2 дней), так как
средняя активность отдельных определений, проведенных в разные
дни, - более надежная величина, чем средняя активность, полученная
в результате такого же количества определений, проведенных
одновременно.
Расчет ошибки определения логарифма концентрации испытуемого
образца в пределах одного опыта приведен в приложении 1 к
настоящей статье. Объединение результатов отдельных опытов
проводят в соответствии с формулами, приведенными в приложении 2
к настоящей статье.
Во всех сомнительных случаях и при определении активности
стандартных образцов должен использоваться только трехдозный
вариант метода диффузии в агар.
Для определения содержания активного вещества во флаконе
активность, найденную в 1 мг, умножают на массу содержимого
флакона, выраженную в миллиграммах. При исследовании раствора,
приготовленного из всего содержимого флакона или ампулы,
активность, найденную в 1 мл этого раствора, умножают на его
объем. В случае необходимости определения содержания активного
вещества в 1 мг испытуемого образца следует величину,
характеризующую содержание активного вещества во флаконе,
разделить на массу содержимого флакона, выраженную в миллиграммах.
При определении содержания активного вещества в таблетках или
капсулах их количество, а также подготовка для анализа должны
соответствовать требованиям общих статей ГФ XI издания "Таблетки"
(с. 154) и "Капсулы" (с. 143). В дальнейшем основной раствор
испытуемого образца готовят из расчета 1 мг в 1 мл. После
перемешивания раствору дают отстояться или центрифугируют. Рабочий
раствор испытуемого образца готовят разведением надосадочной
жидкости основного раствора. Для определения содержания активного
вещества в 1 таблетке или капсуле активность 1 мг порошка
растертых таблеток или содержимого капсул умножают на среднюю
массу таблетки или содержимого капсулы, выраженную в миллиграммах.
При исследовании таблеток, покрытых оболочкой, активность
определяют в нескольких растворенных таблетках, количество которых
и растворитель должны быть указаны в частных статьях. Активность,
найденную в 1 мл основного раствора, умножают на его объем и делят
на количество растворенных в этом объеме таблеток.
Выращивание и хранение культур тест - микробов <*>. Все
культуры тест - микробов сохраняют в запаянных пробирках на
соответствующих плотных питательных средах в течение 15-30 сут при
температуре от 4 до 10 град. С, после чего пересеивают на свежую
питательную среду. Тест - микробы можно сохранять и в
лиофилизированном состоянии.
--------------------------------
<*> Штаммы тест - микробов, за исключением Candida utilis
ЛИА-01, применяемые для определения антимикробной активности
антибиотиков, хранятся в музее патогенных и условно патогенных
культур при Государственном научно - исследовательском институте
стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им.
Л. А. Тарасевича. Candida utilis ЛИА-01 хранится во Всесоюзном
научно - исследовательском технологическом институте антибиотиков
и ферментов медицинского назначения (ВНИТИАФ).
Для характеристики культурных свойств микроорганизмов (см.
табл. 18) производится их высев в пробирки с мясо - пептонным
бульоном (МПБ), затем через 18-20 ч инкубации при температуре (36
+/-1) град. С культуры высеивают на чашки Петри с плотной средой
для выделения типичных колоний, которые затем пересевают на
соответствующие питательные среды для получения в дальнейшем
взвесей вегетативных клеток или спор. Взвесь хранят в запаянных
стеклянных пробирках при температуре от 4 до 10 град. С в течение
определенного срока.
В полученной взвеси определяют концентрацию клеток (спор) по
оптическому стандарту мутности <*> или нефелометрически (основная
взвесь). Из этой взвеси по мере надобности готовят рабочую взвесь
в соответствии с посевной дозой, предусмотренной для каждого
тест - микроба (см. табл. 17).
--------------------------------
<*> Оптические стандарты мутности и инструкция по их
использованию выпускаются и рассылаются Государственным научно -
исследовательским институтом стандартизации и контроля медицинских
биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича.
Культуру тест - микроба Staphylococcus aureus 209P высевают на
чашки Петри со средой N 1 и после выращивания в течение 18-20 ч
при (364 +/-1) град. С оставляют при комнатной температуре на 24 ч
для наблюдения за образованием пигмента. Отбирают типичные колонии
и пересевают их в пробирки со скошенным агаром того же состава.
Для определения активности используют взвесь 18-20-часовой
культуры стафилококка, выращенной в пробирке на скошенном агаре.
Возможно также применение в течение длительного времени взвеси
культуры, полученной следующим образом: культуру выращивают в
течение 18-20 ч на скошенном агаре в пробирке, смывают ее 5-10 мл
стерильного раствора хлорида натрия изотонического 0,9%.
Полученной взвесью засевают матрац с 300 мл среды N 1 (со
скошенной поверхностью), выращивают в течение 2 сут [сутки при
(36 +/-1) град. С и сутки при комнатной температуре], смывают
примерно 50 мл стерильного раствора хлорида натрия изотонического
0,9%. Взвесь культуры можно хранить в запаянных пробирках в
течение 5-7 нед при температуре от 4 до 10 град. С.
Культуру тест - микроба Bordetella bronchiseptica (ATCC 4617
гладкая форма) выращивают так же, как указано для Staphylococcus
aureus 209P, за исключением времени инкубации, которое составляет
для Bordetella bronchiseptica 30-36 ч. Посевным материалом служит
культура, выращенная в пробирках со скошенным агаром и хранящаяся
при температуре от 4 до 10 град. С не более 2 нед. Для длительного
применения взвеси клеток культуру смывают с питательной среды 5-10
мл стерильного раствора натрия хлорида изотонического 0,9%,
засевают матрац со средой N 1 (со скошенной поверхностью) и далее
поступают так же, как при подготовке культуры Staphylococcus
aureus 209P. Взвесь клеток Bordetella bronchiseptica ATCC 4617
может храниться в течение 7 сут.
Культуру тест - микроба Pseudomonas aeruginosa N CTC 2134
выращивают на чашках Петри со средой N 1 в течение 18-20 ч при
температуре (36 +/-1) град. С, отбирают типичные колонии,
пересевают их на мясо - пептонный бульон рН от 7,2 до 7,4 и
выращивают в вышеуказанных условиях. Полученная культура служит
посевным материалом для приготовления суточной культуры,
используемой при определении активности в каждом конкретном опыте,
и может храниться в течение 30 сут при температуре от 4 до 10
град. С.
Культуру тест - микроба Candida utilis ЛИА-01 выращивают на
чашках Петри со средой N 3 в течение 48 ч при температуре (30
+/-1) град. С, отбирают типичные колонии, пересевают их в пробирки
со скошенным агаром того же состава и выращивают в указанных выше
условиях. Полученная культура служит посевным материалом для
приготовления взвеси клеток, применяемой в течение длительного
времени. Для этого культуру с поверхности среды смывают 5-10 мл
стерильного раствора натрия хлорида изотонического 0,9% и засевают
матрац с 300 мл среды N 3 (со скошенной поверхностью). Через 2 сут
культуру смывают 50 мл стерильного раствора натрия хлорида
изотонического 0,9%. По мере надобности готовят рабочую взвесь,
густота которой должна быть такой, чтобы при разведении ее в 30
раз 0,9% раствором натрия хлорида изотонического оптическая
плотность составляла 0,22-0,23. Для определения густоты взвеси
используют нефелометр с нейтральным светофильтром и кюветы с
толщиной слоя 3 мм. Рабочая взвесь может храниться в течение 30
сут.
При использовании спорообразующих культур тест - микробов
процесс выращивания на чашках Петри, отбор типичных колоний,
пересев на пробирки со скошенным агаром и на матрацы осуществляют
так же, как указано для Staphylococcus aureus 209P.
Для выращивания культур тест - микробов Вас. subtilis, var. Л2
и Вас. pumilus N CTC 8241 на чашках Петри и пробирках используют
среду N 1, при выращивании на матрацах - среду N 4; для
выращивания культур тест - микробов Вас. cereus, var. mycoides HB
и Вас. subtilis ATCC 6633 на чашках Петри и пробирках используют
среду N 1, при выращивании на матрацах - среду N 5; для
выращивания культуры тест - микроба Вас. cereus, var. mycoides 537
на чашках Петри и на пробирках используют среду N 2, при
выращивании на матрацах - среду N 4.
Для получения взвеси спор культуру, выращенную в пробирках,
смывают 5-10 мл стерильного раствора натрия хлорида изотонического
0,9%, засевают ею несколько матрацев с 300 мл питательной среды
(со скошенной поверхностью) и выращивают в течение 5-7 сут. В
процессе выращивания периодически производят микроскопический
контроль культуры, и если в мазках, окрашенных по Граму, имеется в
поле зрения 80-90% спор, производят смыв стерильной
дистиллированной водой.
Полученную взвесь спор прогревают при температуре от 60 до 70
град. С в течение 30 мин. Затем промывают стерильной
дистиллированной водой при центрифугировании до полной
прозрачности надосадочной жидкости. Промытую взвесь спор вновь
прогревают в течение 30 мин при температуре от 60 до 70 град. С.
Взвесь спор хранят в запаянных стеклянных пробирках при
температуре от 4 до 10 град. С и используют до тех пор, пока
интенсивность роста и четкость зон при определении антимикробной
активности препаратов удовлетворяют предъявляемым требованиям.
Для заражения питательных сред допускается использование
лиофилизированных тест - культур с точно известным содержанием
количества микробных клеток (спор) в ампуле, которые после
суспендирования в соответствующем растворителе (растворе натрия
хлорида изотонического 0,9% или дистиллированной воде) вносят в
питательную среду без предварительного пересева.
Питательные среды и буферные растворы. В табл. 19 представлен
состав сред, используемых при определении активности антибиотиков.
Для приготовления сред N 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 13, 14, 15, 16
применяют ферментативный гидролизат биомассы микроорганизмов без
оболочек. Методика приготовления состоит в следующем: 5 г сухого
ферментативного гидролизата размешивают в 1 л дистиллированной
воды, прибавляют агар - агар, расплавленный в открытом котле или
автоклаве текучим паром или под давлением 0,05 МПа и температуре
(111 +/- 1) град. С в течение 30 мин. В случае необходимости в
среду прибавляют соли в количестве, указанном в прописи сред; рН
сред определяют потенциометрически со стеклянными электродами или
колориметрически. Реакцию среды (рН) корригируют
хлористоводородной кислотой или раствором едкого натрия.
Готовые среды разливают в соответствующую посуду и стерилизуют
в автоклаве при 0,1 МПа и температуре (120 +/- 1) град. С в
течение 15 мин.
Таблица 19
Состав питательных сред для выращивания
тест - культур, получения спор и
определения активности антибиотиков
-----------------T------------------------------------------------¬
¦ ¦ Номера сред ¦
¦ Ингредиенты +-------T-------T-------T-------T-------T--------+
¦ ¦ 1 ¦ 2 ¦ 3 ¦ 4 ¦ 5 ¦ 6 ¦
+----------------+-------+-------+-------+-------+-------+--------+
¦ Содержание каждого ингредиента ¦
+----------------T-------T-------T-------T-------T-------T--------+
¦Мясо - пептонный¦1000 мл¦1000 мл¦1000 мл¦ 5 г ¦ 5 г ¦ 5 г ¦
¦бульон 1:2 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦Ферментативный ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦гидролизат био-¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦массы микроорга-¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦низмов без обо-¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦лочек ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦Агар - агар ¦ 20 г ¦ 20 г ¦ 17 г ¦ 25 г ¦ 25 г ¦ 10-15 г¦
¦Глюкоза ¦ ¦ ¦ 10 г ¦ ¦ ¦ ¦
¦Натрия фосфат ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦двузамещенный ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦Калия фосфат ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦однозамещенный ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦Натрия хлорид ¦ ¦ ¦ 5 г ¦ ¦ ¦ ¦
¦Калия хлорид ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦Мочевина ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦Аммония цитрат ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦двузамещенный ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦Аммония хлорид ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦Вода ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦дистиллированная¦ ¦ ¦ ¦1000 мл¦1000 мл¦1000 мл ¦
¦рН после ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦стеризации ¦7,0-7,2¦7,8-8,0¦7,0-7,2¦6,0-6,2¦7,8-8,0¦6,8-7,0 ¦
L----------------+-------+-------+-------+-------+-------+---------
Продолжение
-----------------T------------------------------------------------¬
¦ ¦ Номера сред ¦
¦ Ингредиенты +-------T-------T-------T-------T-------T--------+
¦ ¦ 7 ¦ 8 ¦ 9 ¦ 10 ¦ 11 ¦ 12 ¦
+----------------+-------+-------+-------+-------+-------+--------+
¦ Содержание каждого ингредиента ¦
+----------------T-------T-------T-------T-------T-------T--------+
¦Мясо - пептонный¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦бульон 1:2 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦Ферментативный ¦ 5 г ¦ 5 г ¦ 5 г ¦ 5 г ¦ ¦ ¦
¦гидролизат био-¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦массы микроорга-¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦низмов без обо-¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦лочек ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦Агар - агар ¦10-12г ¦10-12г ¦ 15 г ¦10-15г ¦15-20 г¦15-20 г ¦
¦Глюкоза ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦Натрия фосфат ¦ 3 г ¦ 3 г ¦ 3 г ¦ ¦ 3 г ¦ 3 г ¦
¦двузамещенный ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦Калия фосфат ¦ ¦ ¦ ¦ 25 г ¦ ¦ ¦
¦однозамещенный ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦Натрия хлорид ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦Калия хлорид ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦Мочевина ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦Аммония цитрат ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦двузамещенный ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦Аммония хлорид ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦Вода ¦1000 мл¦1000 мл¦1000 мл¦1000 мл¦1000 мл¦1000 мл ¦
¦дистиллированная¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦рН после ¦6,8-7,0¦7,8-8,0¦7,8-8,0¦6,0-6,2¦6,8-7,0¦7,8-8,0 ¦
¦стерилизации ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
L----------------+-------+-------+-------+-------+-------+---------
Продолжение
-----------------T------------------------------------------------¬
¦ ¦ Номера сред ¦
¦ Ингредиенты +-------T-------T-------T-------T-------T--------+
¦ ¦ 13 ¦ 14 ¦ 15 ¦ 16 ¦ 17 ¦ 18 ¦
+----------------+-------+-------+-------+-------+-------+--------+
¦ Содержание каждого ингредиента ¦
+----------------T-------T-------T-------T-------T-------T--------+
¦Мясо - пептонный¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦бульон 1:2 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦Ферментативный ¦ 5 г ¦ 5 г ¦ 5 г ¦ ¦ ¦ 5 г ¦
¦гидролизат био-¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦массы микроорга-¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦низмов без обо-¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦лочек ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦Агар - агар ¦ 20 г ¦ 15 г ¦ 15 г ¦18-20 г¦ 18 г ¦ 15-20 г¦
¦Глюкоза ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ 5 г ¦ 5 г ¦
¦Натрия фосфат ¦ ¦ ¦ ¦ 5 г ¦ 15 г ¦ ¦
¦двузамещенный ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦Калия фосфат ¦ ¦ ¦ 25 г ¦ ¦ ¦ ¦
¦однозамещенный ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦Натрия хлорид ¦ ¦ ¦ ¦ 20 г ¦ ¦ 30 г ¦
¦Калия хлорид ¦ 20 г ¦ ¦ ¦ 20 г ¦ ¦ ¦
¦Мочевина ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ 2 г ¦ ¦
¦Аммония цитрат ¦ ¦ ¦ ¦ 5 г ¦ ¦ ¦
¦двузамещенный ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦Аммония хлорид ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ 2г ¦ ¦
¦Вода ¦1000 мл¦1000 мл¦1000 мл¦1000 мл¦1000 мл¦1000 мл ¦
¦дистиллированная¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦рН после ¦7,0-7,2¦7,8-8,0¦7,0-7,2¦5,8-6,0¦7,8-8,0¦6,8-7,0 ¦
¦стерилизации ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
L----------------+-------+-------+-------+-------+-------+---------
Мясо - пептонный бульон (среда N 1) готовят на водопроводной
воде обычным способом, изложенным в руководствах по микробиологии.
Примечания: 1. Количество агар - агара в средах указано для
цилиндро - чашечной модификации. В случае применения лунок
количество агар - агара увеличивают до 20-25 г на 1000 мл среды.
2. Допускается уменьшение или увеличение содержания агар -
агара в средах в зависимости от его качества.
3. Допускается использование взамен сред с ферментативным
гидролизатом биомассы микроорганизмов (без оболочек) сред с
другими источниками аминного азота:
а) сухих сред на основе сухого рыбного бульона. При
использовании данной среды в отдельных случаях необходимо
изменение посевной дозы тест - микроба и увеличение концентрации
растворов стандартных и испытуемых образцов;
б) сред на основе панкреатического гидролизата мяса (по
Хоттингеру) глубокого расщепления. Среды N 6, 7, 8, 10 должны
содержать 130-140 мг% аминного азота, а среды N 4, 5, 9, 13 - 30 -
35 мг% аминного азота. Для приготовления сред с гидролизатом мяса
применяют дистиллированную воду. Панкреатический гидролизат мяса и
среды на его основе готовят обычным способом, изложенным в
руководствах по микробиологии. Условия проведения анализа на
средах с панкреатическим гидролизатом не отличаются от условий
проведения анализа на средах с ферментативным гидролизатом
биомассы микроорганизмов без оболочек.
При контроле активности антибиотиков применяются буферные
растворы, состав которых приводится в табл. 20.
Таблица 20
Состав буферных растворов
---------------------------T---------------------------------------¬
¦ Ингредиенты буферов ¦ Содержание ингредиентов ¦
¦ +-------T-------T-------T-------T-------+
¦ ¦ 1 ¦ 2 ¦ 3 ¦ 4 ¦ 5 ¦
+--------------------------+-------+-------+-------+-------+-------+
¦Калия фосфат однозамещен- ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ный, г ¦ 3,63 ¦ - ¦ 7,72 ¦ 0,68 ¦ 32 ¦
¦Калия фосфат двузамещен- ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ный, г ¦ - ¦ - ¦ ¦ ¦ 8 ¦
¦Натрия фосфат двузамещен- ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ный, г ¦ 7,13 ¦ - ¦ 1,78 ¦10,99 ¦ - ¦
¦Натрия цитрат трехзамещен-¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ный, г ¦ - ¦ 20,6 ¦ - ¦ - ¦ ¦
¦Кислота хлористоводородная¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦концентрированная, г ¦ - ¦ 1,81 ¦ - ¦ - ¦ ¦
¦Вода дистиллированная, до¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦1000 мл ¦ 1000 ¦ 1000 ¦ 1000 ¦ 1000 ¦ 1000 ¦
¦рН буфера ¦6,8-7,0¦5,8-6,0¦6,0-6,2¦7,8-8,0¦6,0-6,2¦
L--------------------------+-------+-------+-------+-------+--------
Приложение 1
Вычисление ошибки логарифма активности испытуемого S
lg C
U
проводится согласно разделу I.6 фармакопейной статьи
"Статистическая обработка результатов химического эксперимента и
биологических испытаний".
2
Сначала вычисляют величину дисперсии S , характеризующую
0
разброс значений d1, d2, d3, d4, d5 относительно прямой
D = a + b x lg C:
2 5 2
S = [ SUM (di - (а + b x lg Ci)) ] / 3
0 i=1
Тогда:
--------------------------------------------------
/ 2 _ _2
/ S 5 (d - d )
/ 0 1 U S
S = / ----- (0,2 + -- + ------------------------------),
lg C / 2 n 2 5 2 5 2
U \/ b b (5 SUM lg Ci - SUM lg Ci)
i=1 i=1
где n - число параллельных испытаний величины С , приведенных в
U
опыте с одной стандартной кривой; d - среднее значение диаметра
U
зон задержки роста для испытуемого, полученное по n испытаниям; d
S
- среднее значение диаметра зон задержки роста для контрольной
концентрации, полученное по тем же n испытаниям.
Число степеней свободы величины S равно 3.
lg C
U
Пример. Вычислим S c использованием данных примера,
lg C
U
приведенного в основном тексте статьи для иллюстрации вычисления
параметров стандартной кривой.
2
Расчеты S удобно проводить с помощью следующей таблицы.
0
---------T--------T-----T---------T-----------------------T------¬
¦ Ci ¦ lg Ci ¦ di ¦ a + b x ¦ 2¦ 2 ¦
¦ ¦ ¦ ¦ x lg Ci ¦[di - (a + b x lg Ci)] ¦lg Ci ¦
+--------+--------+-----+---------+-----------------------+------+
¦ 3,2 ¦ 0,5051 ¦17,64¦ 17,63 ¦ 0,0001 ¦0,2551¦
¦ 4,00 ¦ 0,6021 ¦18,15¦ 18,26 ¦ 0,0121 ¦0,3625¦
¦ 5,00 ¦ 0,6990 ¦19,03¦ 18,90 ¦ 0,0169 ¦0,4886¦
¦ 6,25 ¦ 0,7959 ¦19,58¦ 19,53 ¦ 0,0025 ¦0,6334¦
¦ 7,8 ¦ 0,8921 ¦20,09¦ 20,16 ¦ 0,0049 ¦0,7958¦
+--------+--------+-----+---------+-----------------------+------+
¦Суммы по¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦столбцам¦ 3,4942 ¦ ¦ ¦ 0,0365 ¦2,5354¦
L--------+--------+-----+---------+-----------------------+-------
При вычислении значений а + b x lg Сi необходимо брать
достаточное число знаков для а и Ь.
Пусть число испытаний образца в опыте n = 1, d = 18,61 и d =
S U
18,44
_
Тогда d = d = 18,61; d = d = 18,44. Найдем S :
S S U U lg C
U
2
S = 0,0365 / 3 = 0,01217;
0
---------------------------------------------------
/ 2
/0,01217 5 x (18,44 - 18,61)
S = / ------- x (0,2 + 1+ x ------------------------------ =
lg C / 2 2 2
U \/ 6,532 6,532 x (5 х 2,5355 - 3,4943)
= 0,0185.
Приложение 2
Объединение результатов n опытов, выполненных с одним и тем же
разведением образца гамма , проводится усреднением значений
U
логарифмов активностей испытуемого с учетом ошибок их определения
в каждом опыте по формуле:
_ N N
lg C = (SUM gj x lg C ) / SUM gj,
U j=1 Uj j=1
2
где gj = 1 / S x lg C .
Uj _
Ошибка определения величины lg С при этом будет равна:
U
------
/ N
S _ = 1 / / SUM gj .
lg C \/ j=1
U
Доверительный интервал для величины логарифма истинной
активности записывается с учетом значения критерия Стьюдента,
взятого из таблиц для доверительной вероятности Р = 0,95 и числа
N
степеней свободы f = SUM fj, где fj - число степеней свободы
j=1
величины S :
lg С
Uj
_
lg C +/- t(P, f) S _
U lg C .
U
Пример. Проведены два опыта по определению активности
препарата. Разведение испытуемого гамма = 200. В первом опыте два
U
испытания дали следующие результаты:
lg С1 = 0,6221; S = 0,0170 при f1 = 3.
lg С1
Во втором опыте по четырем испытаниям имели:
lg C2 = 0,6305; S = 0,0099 при f2 = 3.
lg C2
Для объединения результатов проводят следующие вычисления:
|
