|
Стр. 11
натрия хлорида (наносят пипеткой 2-3 капли).
Испытания на травяных лягушках следует проводить, вводя
растворы в лимфатические бедренные мешки (под кожу), в сердце (в
полость желудочка), на водяных - в сердце (в полость желудочка)
или в вену; под кожу - только растворы, содержащие гликозиды
ландыша.
Лягушкам, относящимся к одной группе (5 штук), вводят
одинаковые дозы испытуемого раствора.
Препараты, подлежащие испытанию, предварительно разводят водой
с таким расчетом, чтобы 0,3 или 0,4 мл испытуемого раствора
соответствовали 1 ЛЕД. Для этого среднее количество единиц
действия препарата умножают на количество миллилитров,
соответствующее 1 ЛЕД. Например, в 1 мл раствора коргликона 0,06 %
для инъекций содержится в среднем 13,3 ЛЕД (13,3 х 0,3 = 3,99, т.
е. разведение препарата 1:4).
а) Метод испытания при введении под кожу. Растворы вводят
шприцем с тонкой иглой в бедренные лимфатические мешки лягушек.
Дозы, не превышающие 0,35 мл, вводят в одну конечность, большие
дозы (но не более 0,7 мл) вводят равными частями в обе конечности.
После введения раствора наблюдают за лягушками и определяют
наименьшую дозу, вызывающую систолическую остановку сердца у
большинства (3-4) из 5 лягушек данной группы в течение 1 ч, если
испытывают сырье и препараты наперстянки, ландыша, горицвета, или
в течение 2 ч, если испытывают сырье и препараты строфанта,
желтушника. Если в течение этого времени отчетливой остановки
сердца не произошло, продолжают наблюдение еще 10 мин (при
длительности наблюдения 1 ч) и учитывают также количество лягушек,
у которых остановка сердца наступила в дополнительное время.
Длительность систолической остановки сердца должна быть не менее
15 мин. Лягушек, у которых сердце начинает вновь сокращаться ранее
чем через 15 мин после остановки, в расчет не принимают.
В протоколах опытов отмечают время введения препарата и
результаты опытов для каждой лягушки в отдельности. Каждое
отдельное испытание начинают с определения чувствительности данной
партии лягушек к стандартному образцу. С этой целью нескольким
группам лягушек по 5 животных в каждой вводят разные дозы
стандартного образца: одной группе - дозу, соответствующую 1 ЛЕД
(по 0,3 или 0,4 мл в зависимости от того, какой применяется
стандарт), другим - на 0,05-0,1 мл больше. Находят наименьшую дозу
стандартного образца, вызывающую остановку сердца у большинства
(3-4) из 5 лягушек, и устанавливают таким образом чувствительность
опытной партии лягушек по сравнению со стандартными лягушками.
Затем в тех же условиях опыта группе из 5 лягушек той же партии
вводят раствор испытуемого препарата в дозе, соответствующей
найденной наименьшей дозе стандартного образца, и наблюдают за
животными в течение 1 или 2 ч (в зависимости от того, какой
препарат испытывается). Если в результате наблюдений будет
установлено, что введенная доза недостаточна или слишком велика,
дозу увеличивают или уменьшают, причем разница между дозами должна
быть не более 0,1 мл. Опыты проводят до тех пор, пока не будет
найдена наименьшая доза испытуемого препарата, вызывающая
систолическую остановку сердца у большинства (3-4) из 5 лягушек.
Далее рассчитывают содержание единиц действия в 1 мл, 1 г или
1 таблетке испытуемого препарата.
Для сырья и препаратов наперстянки, ландыша, горицвета расчет
проводят по формуле:
В х К
---------,
0,3 х А
где А - наименьшая доза в миллилитрах, установленная для раствора
испытуемого препарата; В - наименьшая доза в миллилитрах,
установленная для раствора стандартного образца;
0,3 - доза в миллилитрах, соответствующая 1 ЛЕД; К - число,
обозначающее разведение испытуемого препарата.
Для сырья и препаратов строфанта, желтушника расчет проводят
по формуле:
В х К
---------
0,4 х А
б) Метод испытания при введении в полость желудочка сердца.
Испытуемые растворы, предварительно освобожденные от избытка
спирта (не должен превышать 10%) и летучих веществ, в
соответствующем разведении вводят лягушкам непосредственно в
полость желудочка сердца со скоростью 0,1 мл в 5 с, проколов его в
момент диастолы тонкой иглой, соединенной со шприцем вместимостью
1 мл с двойной шкалой (деления 0,01-0,02 мл). Иглу вынимают из
полости желудочка во время систолы, чтобы избежать кровотечения в
месте укола.
Для определения наименьшей дозы раствора стандартного образца
и испытуемого препарата травяным лягушкам вводят примерно 0,2 мл
препарата наперстянки, ландыша, горицвета или 0,3 мл препарата
строфанта, желтушника. Допустимое отклонение между вводимыми
дозами - 0,02-0,03 мл.
При определении на водяных лягушках рассчитывают вводимую дозу
на 1 г массы тела. Для того чтобы не рассчитывать каждый раз дозу
на введение, предлагается таблица расчетных доз (табл. 9).
Допустимое отклонение между вводимыми дозами должно быть не более
0,0005 мл на 1 г массы лягушки. Наименьшими дозами обычно являются
0,004-0,006 мл раствора на 1 г массы лягушки.
Длительность наблюдения за лягушками - 15 мин, если испытывают
сырье и препараты наперстянки, ландыша, горицвета; для препаратов
строфанта, желтушника - 20 мин. Если в течение этого времени
отчетливой остановки сердца не произошло, наблюдение продолжают
еще 5 мин. Лягушек, у которых сердце начинает вновь сокращаться
ранее чем через 5 мин после остановки, в расчет не принимают.
Таблица 9
Дозы, рассчитанные для введения водяным лягушкам
при оценке препаратов, содержащих сердечные
гликозиды, внутрисердечным и внутривенным путем
---------T----------------------------------------------------------------¬
¦Средняя ¦ Дозы препарата на 1 г массы лягушки, мг ¦
¦ масса +-----T------T-----T------T-----T------T-----T------T-----T------+
¦лягушки,¦0,003¦0,0035¦0,004¦0,0045¦0,005¦0,0055¦0,006¦0,0065¦0,007¦0,0075¦
¦ г +-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+
¦ ¦ Дозы препарата на массу лягушки, мг ¦
+--------+-----T------T-----T------T-----T------T-----T------T-----T------+
¦ 30 ¦0,09 ¦0,10 ¦0,12 ¦0,14 ¦0,15 ¦0,17 ¦0,18 ¦0,20 ¦0,21 ¦0,23 ¦
¦ 35 ¦0,10 ¦0,12 ¦0,14 ¦0,16 ¦0,18 ¦0,19 ¦0,21 ¦0,23 ¦0,25 ¦0,26 ¦
¦ 40 ¦0,12 ¦0,14 ¦0,16 ¦0,18 ¦0,20 ¦0,22 ¦0,24 ¦0,26 ¦0,28 ¦0,30 ¦
¦ 45 ¦0,14 ¦0,16 ¦0,18 ¦0,20 ¦0,22 ¦0,25 ¦0,27 ¦0,29 ¦0,32 ¦0,34 ¦
¦ 50 ¦0,15 ¦0,18 ¦0,20 ¦0,22 ¦0,25 ¦0,28 ¦0,30 ¦0,33 ¦0,35 ¦0,38 ¦
¦ 55 ¦0,17 ¦0,19 ¦0,22 ¦0,25 ¦0,28 ¦0,30 ¦0,33 ¦0,36 ¦0,39 ¦0,41 ¦
¦ 60 ¦0,18 ¦0,21 ¦0,24 ¦0,27 ¦0,30 ¦0,33 ¦0,36 ¦0,39 ¦0,42 ¦0,45 ¦
¦ 65 ¦0,20 ¦0,23 ¦0,26 ¦0,28 ¦0,33 ¦0,36 ¦0,39 ¦0,42 ¦0,45 ¦0,49 ¦
¦ 70 ¦0,21 ¦0,25 ¦0,28 ¦0,32 ¦0,35 ¦0,39 ¦0,42 ¦0,46 ¦0,49 ¦0,52 ¦
¦ 75 ¦0,23 ¦0,26 ¦0,30 ¦0,34 ¦0,38 ¦0,41 ¦0,45 ¦0,49 ¦0,52 ¦0,56 ¦
L--------+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+-----+-------
Вычисляют содержание ЛЕД в 1 мл, 1 г, в 1 таблетке испытуемого
образца по формулам, приведенным для подкожного введения, но
обозначения А и В зависят от принципа расчета доз, т. е. от вида
применяемых лягушек:
А - наименьшая доза (1 мл на массу травяной лягушки или 1 мл
на 1 г массы водяной лягушки), установленная для раствора
испытуемого препарата;
В - наименьшая доза (1 мл на массу травяной лягушки или 1 мл
на 1 г массы водяной лягушки), установленная для раствора
стандартного образца.
в) Метод испытания при введении в вену. У лягушек проводят
поперечный разрез кожи на уровне ключиц, затем по средней линии
живота до симфиза, где надсекают кожу вправо и влево.
Образовавшиеся лоскуты кожи отводят в стороны. На внутренней
поверхности отведенных в сторону лоскутов кожи с каждой стороны
видна большая кожная вена в виде петли, идущей по поверхности
прямой мышцы живота от кожи спины книзу, а затем снова вверх, где
она впадает в верхнюю полую вену. Затем выводят наружу сердце
аналогично методу испытания при введении под кожу. Доску с группой
препарированных животных поворачивают так, чтобы головы лягушек
были обращены к экспериментатору для удобства введения иглы в
нисходящее колено петли вены лягушки.
При введении лягушкам внутривенным способом растворов
стандартных образцов и испытуемых препаратов в соответствующем
разведении, освобожденных от избытка спирта и летучих веществ,
рассчитывают вводимую дозу на 1 г массы тела(см. табл. 9).
Лягушкам, относящимся к одной группе (5 штук), вводят в вену
одинаковые дозы раствора стандартного образца или испытуемого
препарата тонкой иглой, соединенной со шприцем вместимостью 1 мл с
двойной шкалой, со скоростью 0,1 мл в 5 с. После каждого введения
накладывают кровоостанавливающие зажимы, которые не снимают до
конца опыта. Время наблюдения за остановкой сердца лягушки 15 мин,
если испытывают сырье и препараты наперстянки, ландыша, горицвета;
для препаратов строфанта, желтушника - 20 мин. Если в течение
этого времени отчетливой остановки сердца не произошло, наблюдение
продолжают еще 5 мин; о результатах судят по изменениям,
наступающим в дополнительное время.
Определение наименьшей дозы стандартного образца и испытуемого
препарата, вызывающей систолическую остановку сердца у большинства
лягушек (3-4) из 5, проводят так же, как при введении под кожу.
Допустимое отклонение между вводимыми дозами должно быть не более
0,0005 мл на 1 г массы лягушки.
Наименьшими дозами обычно являются 0,004-0,006 мл раствора на
1 г массы лягушки.
Вычисляют содержание ЛЕД в 1 мл, 1 г или 1 таблетке
испытуемого препарата по формулам, приведенным для подкожного
введения, но с другими обозначениями А и В:
А - наименьшая доза (1 мл на 1 г массы лягушки), установленная
для раствора испытуемого препарата;
В - наименьшая доза (1 мл на 1 г массы лягушки), установленная
для раствора стандартного образца.
Б. МЕТОД БИОЛОГИЧЕСКОЙ ОЦЕНКИ
СЕРДЕЧНЫХ СРЕДСТВ НА КОШКАХ
Отбор кошек и их содержание
Для опыта отбирают кошек обоего пола, здоровых, не беременных
и не лактирующих, массой 2-3,5 кг, находившихся в условиях
лабораторного содержания в течение 2-3 сут. За 16- 20 ч до начала
опыта животных лишают пищи, но не воды.
Техника испытания и принцип расчета
Опыт проводят под легким эфирным или уретановым наркозом
(1,5-1,7 г/кг внутримышечно в затылочную часть головы). В
отпрепарированную бедренную вену животного вводят канюлю,
соединенную тонкой каучуковой трубкой с градуированной бюреткой
вместимостью 50-100 мл, откуда поступает раствор испытуемого
препарата, приготовленный на 0,9% растворе натрия хлорида. На пути
между бюреткой и канюлей включают стеклянный змеевик, помещенный в
баню с подогреваемой водой (39 град. С) для поддержания постоянной
температуры вводимого раствора. В резиновую трубку, соединяющую
стеклянный змеевик с канюлей, вставляют с помощью стеклянного
тройника термометр, показывающий температуру жидкости, поступающей
к животному. Жидкость из бюретки вытекает под постоянным
давлением, что достигается введением в бюретку стеклянного
капилляра внешним диаметром не более 1 мм, укрепленного при помощи
каучуковой пробки в верхнем отверстии бюретки (по принципу сосуда
Мариотта). Длина капилляра должна быть такова, чтобы нижний его
конец доходил до уровня нижнего деления бюретки. Скорость
вытекания жидкости из бюретки регулируют при помощи зажима,
наложенного на каучуковую трубку, или стеклянного крана таким
образом, чтобы в вену животного в 1 мин поступал 1 мл испытуемого
раствора. Введение раствора проводят до наступления остановки
сердца. Длительность опыта должна составлять не менее 30 и не
более 55 мин. Момент остановки сердца определяют по исчезновению
сердечного толчка и контролируют последующим вскрытием грудной
клетки. При наличии патологических изменений в органах опыт в
расчет не принимают.
Оценку активности испытуемых препаратов можно проводить 2
способами: 1) по сравнению со стандартным образцом; 2) в кошачьих
единицах действия (КЕД).
Оценка активности испытуемого препарата
по сравнению со стандартным образцом
В опыт берут не менее 12 кошек - по 6 кошек для испытуемого
препарата и стандартного образца. Данные, полученные при
биологическом испытании стандартного образца, могут быть
использованы для расчетов в последующих опытах в течение 15 сут
без повторного испытания.
Из полученных в опыте данных вычисляют величину смертельной
дозы препарата для каждого животного в миллилитрах на 1 кг массы.
_
Находят величину средней смертельной дозы для стандартного (Yc) и
_
испытуемого (Yи) препаратов, а также стандартную ошибку по
формулам I.1.2 и I.1.9 статьи "Статистическая обработка
результатов химического эксперимента и биологических испытаний"
(ГФ XI, вып. 1, с. 199).
Результаты опытов удовлетворяют требованиям метода, если
отношение стандартной ошибки к среднему значению не превышает
5,7%. В противном случае необходимо увеличить число опытов.
Испытуемый препарат считают удовлетворяющим требованиям, если
отношение средних смертельных доз испытуемого препарата и
стандартного образца составляет 90-110%, а их разность не
превышает величины s х t(P, f).
d
Стандартную ошибку разности s вычисляют по формуле I.4.4 (ГФ
d
XI, вып. 1, с 212). Критическое значение t(P, f) находят по
таблице значений t(P, f) из той же статьи "Статистическая
обработка результатов химического эксперимента и биологических
испытаний" (с. 249) при уровне значимости 5%, что соответствует
уровню достоверности 95%. Значение величины t(P, f) зависит от
так называемого числа степеней свободы (f), которое равно общему
_ _
числу опытов, использованных для вычисления Yс и Yи, уменьшенному
на 2.
Пример расчета:
----T-------------------------------T----------------------------¬
¦ ¦ Стандартный образец ¦ Испытуемый препарат ¦
¦ +------T----------T-------------+------T----------T----------+
¦ N ¦ мл/кг¦отклонения¦ квадрат ¦ мл/кг¦отклонения¦квадрат ¦
¦п/п¦ (Yс) ¦от средней¦ отклонений ¦ (Yи) ¦от средней¦отклонений¦
¦ ¦ ¦ _ ¦ _ 2 ¦ ¦ _ ¦ _ 2¦
¦ ¦ ¦(Yс - Yс) ¦ (Yс - Yс) ¦ ¦(Yи - Yи) ¦(Yи - Yи) ¦
+---+------+----------+-------------+------+----------+----------+
¦1 ¦ 15,0 ¦ 2,0 ¦ 4,0 ¦ 16,0 ¦ 2,5 ¦ 6,25 ¦
¦2 ¦ 16,3 ¦ 0,7 ¦ 0,49 ¦ 17,1 ¦ 1,4 ¦ 1,96 ¦
¦3 ¦ 18,2 ¦ 1,2 ¦ 1,44 ¦ 20,0 ¦ 1,5 ¦ 2,25 ¦
¦4 ¦ 17,8 ¦ 0,8 ¦ 0,64 ¦ 19,5 ¦ 1,0 ¦ 1,0 ¦
¦5 ¦ 17,0 ¦ 0 ¦ 0 ¦ 20,0 ¦ 1,5 ¦ 2,25 ¦
¦6 ¦ 17,7 ¦ 0,7 ¦ 0,49 ¦ 18,4 ¦ 0,1 ¦ 0,01 ¦
L---+------+----------+-------------+------+----------+-----------
_ _ 2
Yс = 17,0 мл/кг ; (Yс - Yс) = 7,06;
_ _ _ 2
Yи = 18,5 мл/кг; (Yи - Yи) = 13,72;
---------
_ / 7,06 ------
SYс = +/- /----------- = +/- \/ 0,235 = +/- 0,48 мл/кг;
\/ 6 х (6 - 1)
---------
_ / 13,72 ------
SYи = +/- /----------- = +/- \/ 0,457 = +/- 0,68 мл/кг.
\/ 6 х (6 - 1)
Далее находят отношение стандартной ошибки к среднему значению
для стандартного и испытуемого препаратов соответственно.
_
SYс х 100 0,48 х 100
--------- = +/- ----------- = +/- 2,8%;
_
Yс 17,0
_
SYи х 100 0,68 х 100
--------- = +/- ----------- = +/- 3,68%.
_
Yи 18,5
Из расчетных данных видно, что эти величины меньше 5,7%.
Следовательно, число проведенных опытов является достаточным и
можно вести расчет дальше.
Активность испытуемого препарата по отношению к стандартному
образцу:
17,0 х 100
---------- = 91%.
18,5
Различие средних: 18,5 - 17,0 = 1,5 мл/кг.
Стандартную ошибку разности находят по формуле I.4.4 (ГФ XI,
вып. 1, с. 212).
-------------
_ _ / 7,06 + 13,72
s = SYс - Yи = +/- / ------------- = +/- 0,8 мл/кг.
d \/ 12 - 2
Величина t при 12 - 2 = 10 равна 2,23 [см. таблицу значений
t(Р, f); ГФ XI, вып. 1, с. 249].
Отсюда s х t = +/- 2,23 х 0,8 = +/- 1,78 мл/кг.
d
Поскольку разность средних (1,5 мл/кг) меньше величины
s х t(1,78 мл/кг), а активность испытуемого препарата отличается
d
от активности стандартного образца на 9%, испытуемый препарат
следует считать удовлетворяющим по своей активности предъявляемым
требованиям.
Определение активности испытуемого препарата в КЕД
Для выражения активности испытуемого препарата в кошачьих
единицах действия (КЕД) расчет проводят для каждого животного по
формуле:
К х m
А = -------
а
где К - разведение испытуемого препарата; m - масса животного в
килограммах; а - доза разведенного препарата в миллилитрах.
Из данных, полученных в опытах, выводят среднее число КЕД и
вычисляют (в КЕД и процентах) отклонения результатов отдельных
опытов от среднего числа КЕД.
Результаты опытов удовлетворяют требованиям метода, если
найденное среднее отклонение от среднего числа КЕД будет меньше
максимально допустимого отклонения для данного числа опытов,
указанного в табл. 10.
Таблица 10
Максимально допустимое отклонение
отдельных опытов от их средней
-------T----------------------T------------T---------------------¬
¦Число ¦ Отклонение, % ¦ Число ¦ Отклонение, % ¦
¦опытов¦ ¦ опытов ¦ ¦
+------+----------------------+------------+---------------------+
¦ 3 ¦ 9,4 ¦ 7 ¦ 16,3 ¦
¦ 4 ¦ 11,5 ¦ 8 ¦ 17,6 ¦
¦ 5 ¦ 13,3 ¦ 9 ¦ 18,9 ¦
¦ 6 ¦ 14,9 ¦ 10 ¦ 20,0 ¦
L------+----------------------+------------+----------------------
Из табл. 10 следует, что испытания можно проводить на 3 кошках
(минимальное число опытов), но только в том случае, если
полученное в опытах отклонение будет меньше 9,4 %. В противном
случае число опытов надо увеличить.
Пример расчета. Определение числа КЕД для раствора строфантина
К 0,05% для инъекций.
----T----------T------------T------T---------T---------------------¬
¦ N ¦ Масса ¦ Разведение ¦ Доза,¦Число КЕД¦ Отклонение ¦
¦п/п¦животного,¦раствора для¦ мл ¦ ¦ от средней ¦
¦ ¦ кг ¦ инъекций ¦ ¦ +----------T----------+
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ КЕД ¦ % ¦
+---+----------+------------+------+---------+----------+----------+
¦1 ¦ 2,63 ¦ 1:50 ¦ 37 ¦ 3,55 ¦ + 0,22 ¦ + 6,6 ¦
¦2 ¦ 2,56 ¦ 1:50 ¦ 39 ¦ 3,28 ¦ - 0,05 ¦ - 1,5 ¦
¦3 ¦ 2,22 ¦ 1:50 ¦ 35 ¦ 3,17 ¦ - 0,16 ¦ - 4,8 ¦
L---+----------+------------+------+---------+----------+-----------
Среднее число КЕД = 3,33.
В. МЕТОД БИОЛОГИЧЕСКОЙ ОЦЕНКИ
СЕРДЕЧНЫХ СРЕДСТВ НА ГОЛУБЯХ
Отбор голубей и их содержание
Для опытов отбирают беспородных здоровых голубей массой
280-400 г, находившихся в условиях лабораторного содержания в
течение 5-7 сут. За 18-24 ч до начала опыта птиц лишают пищи, но
не воды.
Техника испытания и принцип расчета
Опыт проводят под легким тиопентал - натриевым наркозом (35
мг/кг внутримышечно в лапку). Наркотизированных голубей
привязывают к станку для мелких животных в положении на спине
таким образом, чтобы голова голубя находилась ниже туловища (во
избежание попадания в дыхательные пути слизи и рвотных масс). С
внутренней стороны крыла удаляют перья, находят и отсепаровывают
вену крыла. В вену вводят металлическую канюлю (затупленная
инъекционная игла N 19-22), соединенную тонкой каучуковой трубкой
с градуированной бюреткой вместимостью 5 мл, имеющей деления 0,05
мл. Бюретку предварительно наполняют раствором испытуемого
препарата, приготовленным на 0,9% растворе натрия хлорида.
Испытуемый раствор вводят отдельными дозами по 0,3 мл через каждые
5 мин до наступления остановки сердца голубя. Остановку сердца
определяют по характерному изменению положения головы и шеи голубя
и контролируют последующим вскрытием грудной клетки. Длительность
опыта должна составлять не менее 65 и не более 95 мин.
Голуби, смерть которых наступает в другие сроки, в расчет не
принимаются. В течение опыта голубю вводят не менее 13 и не более
19 доз (0,3 мл) испытуемого раствора.
Испытание обычно проводят на 6 голубях.
Результаты опытов могут быть использованы для расчета
биологической активности лишь в том случае, если в одной и той же
серии опытов расхождение между максимальными и минимальными
числами введенных доз не превышает 4, а общее число доз не выходит
за установленные пределы (13-19). В противном случае увеличивают
количество подопытных голубей или повторяют опыт с новой
концентрацией испытуемого раствора. Оценку активности испытуемых
препаратов можно проводить 2 способами: 1) по сравнению со
стандартным образцом; 2) в голубиных единицах действия.
Оценка активности испытуемого препарата
по сравнению со стандартным образцом
В опыт берут не менее 12 голубей - по 6 голубей для
стандартного образца и испытуемого препарата.
Данные, полученные при биологическом испытании стандартного
образца, могут быть использованы для расчета и последующих опытов
в течение 30 сут без повторного испытания.
Из полученных в опыте со стандартным или испытуемым препаратом
данных вычисляют величину смертельной дозы препарата для каждого
голубя в миллилитрах на 1 кг массы.
Результаты опытов подвергают статистической обработке
аналогично результатам опытов на кошках.
Пример расчета при обработке данных - по общей статье
"Статистическая обработка результатов химического эксперимента и
биологических испытаний" (ГФ XI, вып. 1, с. 199).
----T------------------------------T-----------------------------¬
¦ ¦ Стандартный образец ¦ Испытуемый препарат ¦
¦ +--------T--------T------------+-------T---------T-----------+
¦ N ¦ число ¦ число ¦ квадрат ¦ число ¦ число ¦ квадрат ¦
¦п/п¦ доз ¦ мл/кг ¦ отклонений ¦ доз ¦ мл/кг ¦отклонений ¦
¦ ¦ ¦ (Yc) ¦ _ 2 ¦ ¦ (Yи) ¦ _ 2 ¦
¦ ¦ ¦ ¦ (Yc - Yс) ¦ ¦ ¦ (Yи - Yи) ¦
+---+--------+--------+------------+-------+---------+-----------+
¦1 ¦ 16 ¦ 14,9 ¦ 0,81 ¦ 15 ¦ 13,4 ¦ 1,44 ¦
¦2 ¦ 17 ¦ 17,4 ¦ 2,56 ¦ 15 ¦ 15,0 ¦ 0,16 ¦
¦3 ¦ 16 ¦ 15,4 ¦ 0,00 ¦ 18 ¦ 16,1 ¦ 2,25 ¦
¦4 ¦ 18 ¦ 14,4 ¦ 1,96 ¦ 17 ¦ 15,3 ¦ 0,49 ¦
¦5 ¦ 15 ¦ 14,7 ¦ 1,21 ¦ 16 ¦ 14,3 ¦ 0,09 ¦
¦6 ¦ 14 ¦ 18,0 ¦ 4,84 ¦ 18 ¦ 13,5 ¦ 1,21 ¦
L---+--------+--------+------------+-------+---------+------------
Активность испытуемого препарата по отношению к стандартному
образцу:
_ _ 2 _ 2
Y = 15,8; (Yс - Yс) = 11,38; Yи = 14,6; (Yи - Yи) = 5,64;
-----------
_ / 11,38 ------
SYс = +/- /----------- = +/- / 0,379 = +/- 0,61 мл/кг;
\/ 6 x (6 - 1) \/
----------
_ / 5,64 ------
SYи = +/- /----------- = +/- / 0,188 = +/- 0,43 мл/кг;
\/ 6 x (6 - 1) \/
SYс х 100 0,61 х 100
--------- = +/- ------------ = +/- 3,8%;
_
Yс 15,8
_
SYи х 100 0,43 х 100
--------- = +/- ------------ = - 2,9%.
Yи 14,6
15,8 х 100
------------ = 108%.
14,6
Различие средних: 15,8 - 14,6 = 1,2 мл/кг.
---------------------
/ 11,38 + 5,64 12
s = +/- /-------------- х ----- = +/- 0,75 мл/кг.
d \/ 12 - 2 36
Величина t при 12 - 2 = 10 равна 2,23 [см. таблицу значений
t(Р, f); ГФ XI, вып. 1, с. 249].
Отсюда s х t = 0,75 х 2,23 = 1,67 мл/кг.
d
Как видно из полученных данных, разность средних (1,2 мл/кг)
меньше величины s х t(1,67 мл/кг), а активность испытуемого
d
препарата отличается от активности стандартного лишь на 8%.
Следовательно, испытуемый препарат по своей активности
удовлетворяет требованиям.
Определение активности испытуемого препарата в ГЕД
Для выражения активности испытуемого препарата в голубиных
единицах действия (ГЕД) расчет проводят для каждого голубя по
формуле:
К х m
А = -----
а
где К - разведение испытуемого препарата; m - масса голубя в
килограммах; а - доза разведенного препарата в миллилитрах.
Из данных, полученных в опытах, выводят среднее число ГЕД и
вычисляют в процентах отклонение отдельных опытов от среднего
числа.
Пример расчета. Определение числа ГЕД для строфантина К.
------T---------T-----------T--------T-------T-----T-------------¬
¦ N ¦ Масса ¦ Разведение¦ Число ¦ Доза, ¦Число¦ Отклонение ¦
¦опыта¦ голубя,¦ гликозида ¦введений¦ мл ¦ ГЕД ¦ от средней, ¦
¦ ¦ кг ¦ ¦ (доз) ¦ ¦ ¦ % ¦
+-----+---------+-----------+--------+-------+-----+-------------+
¦1 ¦ 0,335 ¦ 1:60000 ¦ 15 ¦ 4,5 ¦4467 ¦ 8,9 ¦
¦2 ¦ 0,301 ¦ 1:60000 ¦ 15 ¦ 4,5 ¦4013 ¦ 2,1 ¦
¦3 ¦ 0,335 ¦ 1:60000 ¦ 18 ¦ 5,4 ¦3722 ¦ 9,2 ¦
¦4 ¦ 0,325 ¦ 1:60000 ¦ 17 ¦ 5,1 ¦3823 ¦ 6,8 ¦
¦5 ¦ 0,332 ¦ 1:60000 ¦ 16 ¦ 4,8 ¦4150 ¦ 1,1 ¦
¦6 ¦ 0,400 ¦ 1:60000 ¦ 18 ¦ 5,4 ¦4445 ¦ 8,3 ¦
L-----+---------+-----------+--------+-------+-----+--------------
Среднее число ГЕД = 4103.
Сведения о требуемом содержании ЛЕД, КЕД и ГЕД в отдельных
препаратах и растительном сырье, а также методики их определения
приведены в соответствующих фармакопейных статьях.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ИНСУЛИНА
Активность испытуемого препарата инсулина определяют путем
сопоставления его гипогликемического (сахаропонижающего) действия
с гипогликемическим действием стандартного образца инсулина.
Стандартный образец и единица действия инсулина
Стандартный образец инсулина представляет собой препарат
высокоочищенного инсулина, активность которого определена путем
многократного сопоставления с активностью международного стандарта
и составляет не менее 25 ЕД в 1 мг. За единицу действия (ЕД)
принимают специфическую активность количества массы стандартного
образца, эквивалентного по биологическому действию 1 международной
единице инсулина.
Примечание. Приготовление растворов стандартного образца и
испытуемого препарата инсулина. Точную навеску стандартного
образца инсулина растворяют в растворе хлористоводородной кислоты
(0,003 моль/л) с рН 2,7-3,0, содержащем консервант в такой же
концентрации, как испытуемый препарат.
Срок годности основного раствора стандартного образца инсулина
4 мес при температуре 4 град. С.
Перед опытом основной раствор стандартного образца инсулина
разводят раствором хлористоводородной кислоты (0,003 моль/л) до
концентрации 1 ЕД в 1 мл. Испытуемый препарат инсулина разводят
этим же раствором хлористоводородной кислоты до концентрации 1 ЕД
в 1 мл, исходя из его предполагаемой активности.
Метод определения биологической активности
Определение биологической активности инсулина проводят на
здоровых кроликах массой 2,5-3,5 кг. Животных массой 1,8-2,3 кг
предварительно не менее 14 сут содержат в условиях вивария, где
они получают овес, сено или свежую траву, корнеплоды,
комбинированный корм и воду. По истечении этого срока определяют
чувствительность кроликов к инсулину. Для этого кроликам дважды с
интервалом 7-8 сут после 18 ч голодания вводят подкожно раствор
стандартного образца инсулина из расчета 0,5 ЕД на 1 кг массы тела
животного и определяют величину снижения концентрации сахара в
крови в процентах. Кровь для исследования берут из краевой вены
уха животных до введения инсулина и через 1,5 и 2,5 ч после его
введения (для расчета берут среднюю концентрацию сахара в крови из
двух определений после введения инсулина). Кровь берут в условиях,
не допускающих чрезмерного волнения кроликов. Из опытов исключают
животных с исходной концентрацией сахара в крови ниже и выше
пределов, установленных для используемого метода определения
содержания сахара в крови (ниже 75 мг % и выше 120 мг % для
феррицианидного метода, ниже 52 мг % и выше 94 мг % для
глюкозооксидазного метода), а также тех животных, которые
реагируют на введение инсулина судорогами или у которых снижение
концентрации сахара в крови составляет менее 15% по отношению к
исходной концентрации. Определение биологической активности
инсулина проводят не ранее чем через 7-8 сут после испытания на
чувствительность.
Отобранных для опытов кроликов лишают корма (но не воды) на 18
ч, предшествующих введению инсулина. Животных распределяют на две
группы способом случайного выбора (в каждой группе должно быть не
менее 9 кроликов). Непосредственно перед введением инсулина
кроликов взвешивают, и определяют исходную концентрацию сахара в
крови. Кроликам одной группы вводят подкожно по 0,5 ЕД
стандартного образца инсулина (S) на 1 кг массы тела, кроликам
другой группы - такую же дозу испытуемого препарата инсулина (Т).
Через 1,5 и 2,5 ч после введения инсулина у животных снова
определяют концентрацию сахара в крови.
Для каждого кролика рассчитывают снижение концентрации сахара
(X) в крови в процентах по формуле:
а - b
Х = ------- х 100,
а
где а - исходная концентрация сахара в крови в миллиграмм -
процентах; b - средняя концентрация сахара в крови в миллиграмм -
процентах из двух определений, проведенных через 1,5 и 2,5 ч после
введения инсулина.
Как и при испытании кроликов на чувствительность к инсулину,
при расчетах не учитывают животных с исходной концентрацией сахара
в крови ниже и выше пределов, установленных для используемого
метода, а также реагирующих на указанную дозу инсулина судорогами
или дающих снижение концентрации сахара в крови менее 15 % по
отношению к исходной концентрации.
Через 3-5 сут на этих же кроликах проводят повторное испытание
с той разницей, что животным из группы, получавшей стандартный
образец инсулина (S), вводят испытуемый препарат инсулина (Т), а
животным группы, получавшей (Т), вводят (S).
Рассчитывают среднюю величину снижения концентрации сахара в
крови на стандартный образец (%S) и на испытуемый препарат (%Т) по
данным всего опыта. Отношение %T / %S выражает относительную
активность (R) испытуемого препарата (Т). Для выражения активности
испытуемого препарата (Т) в ЕД его предполагаемую активность (А)
умножают на R: Т = R х A.
Пример: при определении биологической активности инсулина для
инъекций с предполагаемой активностью 40 ЕД в 1 мл получили
следующие величины снижения концентрации сахара в крови в
процентах (Y).
Первая часть испытания Вторая часть испытания
Ys Yт Yт Ys
49 48 50 50
61 50 58 51
35 48,5 53 41
55 65 55 55
39 46 39 45
28 22,5 68 60
53 15 38 43
38 48 44 60
50 63 44 56
869
SUM Ys = 869; %S = ----- = 48,28.
18
%Т 45,83
R = ----- = ------ = 0,949.
%S 48,28
825
SUM Yт = 825; %Т = ----- = 45,83.
18
Активность Т в ЕД, по данным этого опыта, равна:
Т = 0,949 х 40 = 37,96 ЕД в 1 мл.
Определение проводят не менее 2 раз с каждым испытуемым
образцом (Т). Среднюю величину при этом получают, объединяя
индивидуальные цифры снижения концентрации сахара в крови в
процентах в обоих опытах. При расчете окончательного результата
должны быть использованы данные, полученные не менее чем на 30
кроликах. Если средняя величина R, по данным двух или большего
числа опытов, будет меньше 0,85 или больше 1,15, испытание
проводят заново, исходя из новой величины предполагаемой
активности испытуемого препарата.
Кролики могут быть использованы повторно для определения
биологической активности не ранее чем через 2 нед после окончания
предшествующего опыта. Продолжительность использования кроликов в
опытах по определению биологической активности инсулина не должна
превышать 5 мес.
Определение содержания сахара (глюкозы) в крови
Содержание сахара (глюкозы) в крови при определении
биологической активности инсулина чаще всего проводят
феррицианидным (метод Хагедорна - Йенсена) или глюкозооксидазным
методом, однако возможно применение и других методов.
Рекомендуется использование готовых наборов реактивов и
автоматизированных приемов, в частности автоматических аппаратов
для определения сахара (глюкозы) в крови.
Феррицианидный метод (метод Хагедорна - Йенсена). К 5 мл 0,45%
раствора цинка сульфата в пробирке прибавляют 1 мл раствора натра
едкого (0,1 моль/л) и затем 0,1 мл крови. Пробирку помещают на 5
мин в кипящую водяную баню, после чего смесь фильтруют в колбу для
титрования через воронку с ватой (специально приготовленной).
Пробирку дважды промывают 3 мл воды. Промывные воды присоединяют к
фильтрату. К фильтрату прибавляют 2 мл раствора калия феррицианида
(красной кровяной соли, 0,005 моль/л), смесь помещают в кипящую
водяную баню на 20 мин, затем охлаждают в холодной воде. К смеси
прибавляют 3 мл хлорцинкйодистого ("тройного") раствора, 3 мл 3%
раствора уксусной кислоты и 2 капли 1% раствора крахмала.
Освободившийся йод титруют раствором натрия тиосульфата (0,005
моль/л). Параллельно титруют контрольную пробу (не содержащую
крови), обработанную теми же реактивами.
Количество натрия тиосульфата, пошедшего на титрование,
зависит от концентрации сахара в крови. Эту концентрацию
рассчитывают с помощью табл. 11, составленной для раствора натрия
тиосульфата (0,005 моль/л), пошедшего на титрование сахара в
пробе. В первом вертикальном столбце указаны целые и десятые, а в
верхнем горизонтальном ряду - сотые доли миллилитра раствора
натрия тиосульфата. На пересечении этих двух рядов находят цифру,
выражающую концентрацию сахара (мг %) в титруемой пробе. Из
опытной пробы вычитают контрольную пробу и получают окончательную
величину содержания сахара в крови кролика.
Таблица 11
Расчет содержания сахара в миллиграммах в 0,1 мл
крови при использовании 0,005 моль/л
раствора натрия тиосульфата (феррицианидный метод)
------T-----------------------------------------------------------¬
¦Тио- ¦ Сотые доли миллилитра тиосульфата ¦
¦суль-+-----T-----T-----T-----T-----T-----T-----T-----T-----T-----+
¦фат, ¦0,00 ¦0,01 ¦0,02 ¦0,03 ¦0,04 ¦0,05 ¦0,06 ¦0,07 ¦0,08 ¦0,09 ¦
¦мл ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+-----+-----+-----+-----+-----+-----+-----+-----+-----+-----+-----+
¦0,0 ¦0,385¦0,382¦0,379¦0,376¦0,373¦0,370¦0,366¦0,364¦0,361¦0,358¦
¦0,1 ¦0,355¦0,352¦0,350¦0,348¦0,345¦0,343¦0,341¦0,338¦0,336¦0,333¦
¦0,2 ¦0,331¦0,329¦0,327¦0,325¦0,323¦0,321¦0,318¦0,316¦0,314¦0,312¦
¦0,3 ¦0,310¦0,308¦0,306¦0,304¦0,302¦0,300¦0,298¦0,296¦0,294¦0,292¦
¦0,4 ¦0,290¦0,288¦0,286¦0,284¦0,282¦0,280¦0,278¦0,276¦0,274¦0,272¦
¦0,5 ¦0,270¦0,268¦0,266¦0,264¦0,262¦0,260¦0,259¦0,257¦0,255¦0,253¦
¦0,6 ¦0,251¦0,249¦0,247¦0,245¦0,243¦0,241¦0,240¦0,238¦0,236¦0,234¦
¦0,7 ¦0,232¦0,230¦0,228¦0,226¦0,224¦0,222¦0,221¦0,219¦0,217¦0,215¦
¦0,8 ¦0,213¦0,211¦0,209¦0,208¦0,206¦0,204¦0,202¦0,200¦0,199¦0,197¦
¦0,9 ¦0,195¦0,193¦0,191¦0,190¦0,188¦0,186¦0,184¦0,182¦0,181¦0,179¦
¦1,0 ¦0,177¦0,175¦0,173¦0,172¦0,170¦0,168¦0,166¦0,164¦0,163¦0,161¦
¦1,1 ¦0,159¦0,157¦0,155¦0,154¦0,152¦0,150¦0,148¦0,146¦0,145¦0,143¦
¦1,2 ¦0,141¦0,139¦0,138¦0,136¦0,134¦0,132¦0,131¦0,129¦0,127¦0,125¦
¦1,3 ¦0,124¦0,122¦0,120¦0,119¦0,117¦0,115¦0,113¦0,111¦0,110¦0,108¦
¦1,4 ¦0,106¦0,104¦0,102¦0,101¦0,099¦0,097¦0,095¦0,093¦0,092¦0,090¦
¦1,5 ¦0,088¦0,086¦0,084¦0,083¦0,081¦0,079¦0,077¦0,075¦0,074¦0,072¦
¦1,6 ¦0,070¦0,068¦0,066¦0,065¦0,063¦0,061¦0,059¦0,057¦0,056¦0,054¦
¦1,7 ¦0,052¦0,050¦0,048¦0,047¦0,045¦0,043¦0,041¦0,039¦0,038¦0,036¦
¦1,8 ¦0,034¦0,032¦0,031¦0,029¦0,027¦0,025¦0,024¦0,022¦0,020¦0,019¦
¦1,9 ¦0,017¦0,015¦0,014¦0,012¦0,010¦0,008¦0,007¦0,005¦0,003¦0,002¦
L-----+-----+-----+-----+-----+-----+-----+-----+-----+-----+------
Примечания. 1. Приготовление 0,45% раствора цинка сульфата.
4,5 г цинка сульфата растворяют в воде в мерной колбе вместимостью
1 л и доводят объем раствора водой до метки. Срок годности
раствора 7-10 сут.
2. Приготовление хлорцинкйодистого ("тройного") раствора: 5 г
цинка сульфата и 2,5 г калия йодида растворяют в 100 мл
насыщенного раствора натрия хлорида. Раствор должен быть
свежеприготовленным.
3. Приготовление раствора натрия тиосульфата (0,005 моль/л):
25 г натрия тиосульфата помещают в мерную колбу вместимостью 1 л и
растворяют в свежепрокипяченной и охлажденной до комнатной
температуры воде. Объем раствора в колбе доводят водой до метки.
Выдерживают 10 сут в защищенном от света месте. Перед
употреблением полученный раствор разводят водой в 20 раз, для чего
25 мл раствора помещают в мерную колбу вместимостью 0,5 л, доводят
водой до метки и тщательно взбалтывают. Титр полученного раствора
устанавливают с помощью раствора калия йодата (0,005 моль/л). Если
раствор натрия тиосульфата оказывается менее концентрированным,
чем 0,005 моль/л, то по каплям прибавляют основной раствор
тиосульфата. Если раствор более концентрированный, то прибавляют
воду и добиваются, чтобы окончательный раствор был точно 0,005
моль/л (для удобства подсчета).
4. Приготовление раствора калия йодата (0,005 моль/л). 0,1782
г калия йодата, предварительно высушенного до постоянной массы,
растворяют в воде в мерной колбе вместимостью 1 л.
5. Приготовление раствора калия феррицианида (0,005 моль/л):
|
